Glikoproteina Tamm-Horsfall łączy wrodzoną aktywację komórek immunologicznych z odpornością adaptacyjną poprzez mechanizm zależny od receptora Toll-4 ad 7

Chociaż podobnie traktowany jest jako peptyd o bezpośredniej aktywności przeciwdrobnoustrojowej, a -defensyna 2 ma właściwości stymulujące DC, w tym proces zależny od TLR4 (11). Nasze odkrycia poszerzają w ten sposób zrozumienie funkcji THP w antybakteryjnych mechanizmach obronnych i mogą mieć szerokie implikacje dla regulacji odpowiedzi immunologicznych w drogach moczowych. Metody Media i odczynniki. LPS (Escherichia coli 0111: B4) zakupiono od Sigma-Aldrich Chemie GmbH. Ludzki THP wyizolowany ze sterylnego moczu od zdrowych osób, oczyszczony przez 3 powtarzające się cykle wytrącania w 0,58 M NaCl i odwirowanie, jak opisano (45), zakupiono od Accurate Chemical & Scientific Corp. Czystość oceniono za pomocą pojedynczego homologicznego prążka przy 92 kDa w SDS-PAGE. Mysie THP oczyszczono z jałowego moczu od samic myszy C57BL / 6 przez wytrącanie w 0,58 M NaCl, jak opisano (46) lub przez dializę wobec PBS, stosując membranę do dializy Spectra / Por Biotech RC o 50 kDa z Spectrum Laboratories Inc. W celu dalszego oczyszczenia THP strącanie THP rozcieńczono buforem fosforanu sodu, pH 6,3, do stężenia 70 mM w celu indukcji tworzenia żelu THP i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie próbkę poddano ultrawirowaniu przy 109 000 g przez 30 minut w 10 ° C, a osad rozpuszczono w H2O i dializowano wobec wody (23). Frakcja peletkowa zawierała większość THP ocenianą na podstawie SDS-PAGE. Frakcję peletki dalej oczyszczono, doprowadzając roztwór do 140 mM NaCl i 250 mM buforu fosforanowego, pH 7,5, który indukuje tworzenie żelu. Próbkę THP następnie dodano na kolumnę zawierającą ziemię okrzemkową, przemyto PBS i eluowano przez dodanie H2O jak opisano (24). Inhibitory MAPK SB203580, PD98059 i UO126 i inhibitor NF-kB SN50 zakupiono od Calbiochem. Polimyksyna B pochodziła z firmy Sigma-Aldrich Chemie GmbH. Podłoże Poli-msyny Affi-Prep pochodziło z Bio-Rad Laboratories Inc. Wszystkie odczynniki, media i bufory stosowane w naszych testach sprawdzono za pomocą testów lizatu amebocytów Limulus (BioWhittaker Inc.) i zawierały mniej niż 0,06 U / ml endotoksyny zgodnie z Standardowa wartość zastrzyku wody Wspólnoty Europejskiej. Peptyd hamujący TIRAP / Mal (28), składający się z sekwencji antennapedia Drosophila umieszczonej na N-końcu aminokwasów 138, 145 TIRAP, zsyntetyzowano za pomocą chemii Fmoc. Tripopitoilo-cysteinylo (Pam3Cys) lipopeptyd zakupiono w EMC Microcollections. Mysie mAb przeciwko ludzkiemu TLR4 (HTA125) pochodziło z eBioscience. IL-12 znakowany PE i TNF-a mAbs były z BD Biosciences. RPMI-1640 (Invitrogen Corp.) uzupełniony 2 mM L-glutaminą, 100 | ig / ml streptomycyny, 100 U / ml penicyliny i 10% FCS (HyClone Laboratories Inc.) zastosowano jako pożywkę hodowlaną. Rekombinowany ludzki GM-CSF (rhGM-CSF) uzyskano z Schering-Plough, a rhIL-4 ze Strathmann Biotech GmbH. Separacja komórek i przygotowanie ludzkich DC. Ludzkie PBMC wyizolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości w porównaniu z Lymphoprep bez endotoksyn (Nycomed Pharma A / S). W celu wzbogacenia monocytów PBMC były pozbawione komórek T przez rozerwanie erytrocytów owcy. Odpoczynkowe limfocyty T wyizolowano przez rozetkę erytrocytów owcy i następną lizę pozostałych erytrocytów w temperaturze 4 ° C. W celu różnicowania DC wzbogacone monocyty hodowano w 50 ng / ml rhGM-CSF i 10 ng / ml rhIL-4 przez 5-7 dni. Aktywację DC indukowano przez dodanie THP lub LPS przez 48 godzin. Badania na myszach. Samice myszy C57BL / 6 otrzymano od Harlan Winkelmann GmbH. Tlr2. / ., Tlr4. / ., Tlr9. / ., i MyD88. /. myszy na podłożu C57BL / 6 były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Myszy stosowano w wieku 6. 8 tygodni. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez sędziego weterynaryjnego (MA58 / 60) z Wiednia, Austria. Makrofagi pochodzące z szpiku kostnego wytworzono przez inkubację 107 komórek szpiku kostnego z ml kondycjonowanej pożywki M-CSF. W badaniach in vivo 50 .g THP lub 50 ng LPS w 100 .l PBS wstrzyknięto dożylnie w żyle ogonowej w dniach 0, 1, 2 i 7. Krew pobrano we wskazane dni, a poziomy Ab wobec THP były zmierzono za pomocą testu ELISA. Pokrótce, 5 .g / ml THP lub OVA powlekano na płytkach MaxiSorp (Nunc A / S) przez noc i stosowano seryjne rozcieńczenia surowicy krwi. Specyficzne wiązanie Ab zostało udowodnione przy użyciu skoniugowanego z peroksydazą fragmentu F (ab.) 2 króliczego anty-mysiego Ab zapewnionego przez Jackson ImmunoResearch. Fenotypowa charakterystyka DC za pomocą analizy FACS. W celu oceny ekspresji markera powierzchniowego komórki inkubowano z mAb skoniugowanym z FITC lub PE przez 30 minut w temperaturze 4 ° C. Do kontroli wykorzystano nie wiążące dopasowane do izotypu mysie IgG skoniugowane z FITC i PE. Komórki analizowano na cytometrze przepływowym FACScalibur (BD Biosciences)
[więcej w: olej lniany na odchudzanie, centrum onkologii warszawa roentgena, paznokcie w kształcie migdałów ]
[więcej w: rak płaskonabłonkowy płuca, podkolanówki kompresyjne, odchudzanie roku vita slim opinie ]