Glikoproteina Tamm-Horsfall łączy wrodzoną aktywację komórek immunologicznych z odpornością adaptacyjną poprzez mechanizm zależny od receptora Toll-4 ad 8

Supernatanty bez komórek zbierano 48 godzin po dodaniu bodźca bakteryjnego. Cytokiny zmierzono za pomocą testu kanapkowego ELISA z użyciem dopasowanych par Abs. Wychwycenie jak również wykrywanie Ab przeciwko ludzkiej IL-12p40 uzyskano z R & D Systems Inc. Abs przeciwko ludzkiemu TNF-a. byli z BD Biosciences. Standardy składały się z ludzkiego rekombinowanego materiału z R & D Systems Inc. Testy były tworzone w dwóch powtórzeniach i były wykonywane zgodnie z zaleceniami producentów. Dolna granica wykrywalności wynosiła 20 pg / ml dla wszystkich cytokin. Barwienie cytoplazmatyczne w celu wytworzenia cytokiny przeprowadzono zgodnie z opisem (47). Pokrótce, monensynę (5 .M) dodano podczas ostatnich 12 godzin stymulacji. DC zbierano i utrwalano przez 20 minut w temperaturze pokojowej przez dodanie 100 .l roztworu FIX (An der Grub Bio Research GmbH). Następnie komórki przemyto jeden raz 4 ml PBS, ponownie zawieszono w 100 .l PBS i permeabilizowano przez dodanie 100 .l roztworu PERM (An der Grub Bio Research GmbH). Wskazane skoniugowane z PE przeciwciało monoklonalne anty-cytokiny inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po intensywnym przemyciu komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Makrofagi myszy RAW 264.7 (5 x 104) stymulowano THP (10 .g / ml), LPS (10 ng / ml) lub CpG (10 .M) w 96-studzienkowych płytkach (końcowa objętość 200 .l). Supernatanty zbierano po 4 i 16 godzinach, a cytokiny mierzono za pomocą kanapkowych zestawów ELISA z R & D Systems Inc. W przypadku MLC, komórki stymulatora napromieniano (30 Gy, źródło 137Cs) i dodano przy rosnącej liczbie komórek do 105 allogenicznych komórek T w 96- płytki do hodowli w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% FCS (całkowita objętość 200 ul / studzienkę). Po 5 dniach komórki poddano pulsacji za pomocą l, Ci [3H] -tymidyny (ICN Pharmaceuticals Inc.). Po kolejnych 18 godzinach komórki zebrano na filtrach z włókna szklanego (Topcount, Packard Instrument Company) i radioaktywność związaną z DNA określono za pomocą mikropłytkowego licznika scyntylacyjnego (Packard Instrument Company). Syntezę DNA wyrażono jako średnią liczbę na minutę hodowli w trzech powtórzeniach. Supernatanty z odpowiednich MLC otrzymano 24 i 48 godzin po inicjacji hodowli i analizowano pod kątem IL-2 i IFN-a. za pomocą ELISA (zarówno wychwytywanie, jak i wykrywanie Ab otrzymano z R & D Systems Inc.). Dolna granica wykrywalności dla tych cytokin wynosiła 20 pg / ml. Biochemiczna analiza zdarzeń transdukcji sygnału. Niedojrzałe DC lub mysie makrofagi RAW 264.7 stymulowano 30 .g / ml THP, 100 ng / ml LPS lub samą pożywką przez 15-30 minut. Aktywację zatrzymano przez dodanie lodowatego buforu do płukania (RPMI-1640). Komórki osadzano przez krótkie odwirowanie (12 000 g przez 20 sekund) i lizowano na lodzie przez 30 minut w TBS, pH 7,4, zawierającym 1% NP-40 (Pierce Biotechnology Inc.), fosfatazę (1 mM ortowanadan sodu, 10 mM NaF, 5 mM pirofosforanu sodu, 25 mM P-glicerofosforanu, 5 mM EDTA) i inhibitory proteazy. Jądra usunięto przez krótkie odwirowanie; supernatanty są nazywane lizatami pełnokomórkowymi. Białka rozdzielono stosując SDS-PAGE i przeniesiono na błonę nitrocelulozową (Hybond ECL, Amersham Biosciences). Przeciwciało przeciw IRAK-1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), Akt (BioVision Inc.) i ERK-2, p38, I. B-. (Santa Cruz Biotechnology Inc.) zastosowano do wykrycia odpowiednich antygenów. Fosforylację białka oceniano stosując Ab skierowane przeciw fosforylowanym izoformom Akt (BioVision Inc.), ERK-1/2 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i p38 (Cell Signaling Technology Inc.). Znakowane peroksydazą drugorzędne Abs (Bio-Rad Laboratories Inc.) zostały użyte do wykrycia wiązania pierwotnego Ab. Chemiluminescencja wytworzona z ulepszonego substratu chemiluminescencyjnego (Roche Diagnostics GmbH) została wykryta na Lumi-Imager (Roche Diagnostics GmbH) (48). Oznaczenie aktywności TF w teście krzepnięcia. Komórki HUVEC wysiewano na 6-studzienkowe płytki w konfluencji 80-90% i hodowano przez noc. Komórki zdrapano z płytek i analizowano pod kątem aktywności TF, jak opisano (49). HUVEC pozostawiono bez leczenia lub traktowano 200 U / ml IFN-y. (R & D Systems Inc.) przez 2 godziny, a następnie stymulowano LPS lub THP we wskazanych stężeniach przez 6 godzin. Komórki przemyto dwukrotnie i zdrapano w ml buforu do krzepnięcia (12 mM octan sodu, 7 mM dietylowy roztwór glukozy i 130 mM chlorek sodu; pH 7,4); 100 .l ponownie zawieszonych komórek zmieszano ze 100 .l cytrynowanego osocza, a czas krzepnięcia mierzono po odwapnieniu 100 ml 20 mM roztworu CaCl2 w 37 ° C.
[hasła pokrewne: badania kontrolne po urlopie macierzyńskim, profilaktin koncentracja, przygotowanie do rektoskopii ]
[patrz też: balsam kapucyński ulotka, pompa insulinowa refundacja, depilacja laserowa twarzy ]