Glikoproteina Tamm-Horsfall łączy wrodzoną aktywację komórek immunologicznych z odpornością adaptacyjną poprzez mechanizm zależny od receptora Toll-4 ad

Te fenotypowe cechy dokładnie pasowały do profilu dojrzewania DC indukowanego przez LPS. Niedojrzałe ludzkie DC pochodzące z monocytów stymulowano THP lub LPS. Profile z cienkimi liniami reprezentują wzorce barwienia z dopasowanym izotypowo kontrolnym Ab, a profile z pogrubionymi liniami reprezentują wybarwianie mAb o wskazanej specyficzności. Dane są reprezentatywne dla 5 niezależnych eksperymentów. Liczby wskazują średnią intensywność fluorescencji swoistego barwienia Ab. (B) Niedojrzałe ludzkie DC stymulowano różnymi stężeniami THP lub LPS. Supernatanty pozbawione komórek zbierano 18 godzin po dodaniu THP lub LPS i analizowano za pomocą testu ELISA. Med, średnia kontrola. (C) Cytokiny wewnątrzkomórkowe barwiono w ludzkich DC 18 godzin po stymulacji, a następnie analizowano za pomocą FACS. Wyniki są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. (D) Makrofagi myszy RAW264.7 eksponowano na THP, LPS i CpG we wskazanych okresach czasu. Supernatanty bez komórek analizowano pod kątem TNF-a. za pomocą testu ELISA. Podobne wyniki uzyskano w 3 innych niezależnych eksperymentach, a dane wyrażono jako średnie. SD trzech powtórzeń hodowli w reprezentatywnym eksperymencie. Ponadto dojrzewanie DC obserwowane przez IL-12p40 i TNF-a produkcję badano w DC stymulowanych THP lub LPS. THP był silnym induktorem prozapalnego wydzielania cytokin (Figura 1B) i wytwarzania (Figura 1C). Zbadaliśmy również, czy THP ma wpływ na mysie komórki mieloidalne. THP indukowało wytwarzanie cytokin w splenocytach, niedojrzałych DC pochodzących z szpiku kostnego i mysiej linii komórkowej makrofagów RAW264.7 w sposób zależny od dawki (Figura 1D i dane nie przedstawione). Dane te wskazują, że THP silnie stymuluje mieloidalne komórki immunokompetentne prowadząc do wytwarzania cytokin i końcowego dojrzewania niedojrzałych DC pochodzących z monocytów. Wykazano, że LPS w stężeniach tak niskich jak 50 pg / ml aktywuje komórki mielomonocytowe (22). Aby wykluczyć możliwość, że skażenie LPS preparatem THP spowodowało stymulację komórek immunologicznych, najpierw przetestowaliśmy pod kątem zawartości endotoksyn materiały użyte do hodowli DC i stwierdziliśmy, że są one pozbawione endotoksyn (<0,06 U / ml), co zostało potwierdzone przez lizat amebocytów Limulus test (dane nie pokazane). Ponadto preinkubowaliśmy sondę THP z polimyksyną B, specyficznym inhibitorem dla LPS, przed dodaniem jej do niedojrzałych DC. Dojrzewanie DC indukowane przez THP było niezależne od LPS, ponieważ polimyksyna B nie wpływała na indukowane THP dojrzewanie DC, ale całkowicie uniemożliwiła aktywację za pomocą LPS (Figura 2A). Podobnie, absorpcja na kolumnie z polimyksyną B, która skutecznie eliminuje LPS, nie wpływa na TNF-a. produkcja indukowana przez preparat THP, ale zniosła odpowiedź na LPS (rysunek 2B). Odwrotnie, traktowanie proteinazą K nie hamowało indukowanego przez LPS TNF-a. produkcja, ale ograniczona aktywacja za pomocą THP. Rycina 2 Dojrzewanie DC indukowane przez THP nie jest spowodowane zanieczyszczeniem LPS lub białkiem. (A) THP i LPS pozostawiono bez leczenia lub wstępnie traktowano polimyksyną B (PMB) przez 2 godziny, a następnie dodano do ludzkich niedojrzałych DC. Po 48 godzinach komórki zebrano i analizowano za pomocą FACS. Profile z cienkimi liniami reprezentują wzorce barwienia z dopasowanym izotypem kontrolnym Ab, a profile z pogrubionymi liniami reprezentują wybarwianie mAb o wskazanej specyficzności. Dane są reprezentatywne dla 5 niezależnych eksperymentów. (B) THP inkubowano z perełkami PMB przez noc. Supernatant analizowano na obecność THP metodą SDS-PAGE. Dodatkowo THP inkubowano z proteinazą K (Prot.K) przez 45 minut, jak opisano (11). Oczyszczone PMB i próbki traktowane proteinazą inkubowano z makrofagami RAW 264.7 przez 18 godzin i analizowano pod kątem TNF-a. LPS jako kontrola była traktowana podobnie. Podobne wyniki uzyskano w innym niezależnym eksperymencie. (C) Wpływ THP i LPS na indukcję aktywności TF w komórkach HUVEC. HUVEC były wcześniej leczone z lub bez IFN-y a następnie wystawiony na działanie THP lub LPS. Do określenia aktywności TF zastosowano 1-etapowy test krzepnięcia. Wyniki są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. (D) LPS, Pam3Cys (P3C), THP wyodrębniono za pomocą standardowego strącania NaCl (THP), THP wyizolowano przez strącanie NaCl i ultrawirowanie (THP-UC) i THP wyizolowano przez strącanie NaCl, ultrawirowanie i filtr z ziemi okrzemkowej (THP-DEF). ) zostały dodane do splenocytów C57BL / 6 przez 20 godzin. Supernatanty bez komórek analizowano pod kątem TNF-a. za pomocą testu ELISA. Ponadto staraliśmy się określić potencjalny efekt funkcjonalny możliwego zanieczyszczenia LPS w preparacie THP. Ostatnie dane pokazały, że THP, w przeciwieństwie do LPS, nie jest w stanie stymulować ekspresji czynnika tkankowego (TF) w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) (18) [patrz też: podkolanówki kompresyjne, przygotowanie do rektoskopii, witamina c lewoskrętna wikipedia ] [więcej w: laserowe wybielanie zębów cena, szczepionki na meningokoki, polana szymoszkowa basen ]