Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. (D) Niedojrzałe ludzkie DC preinkubowane z lub bez wskazanych inhibitorów MAPK eksponowano na THP, LPS lub ośrodek. Supernatanty pozbawione komórek zbierano po 18 godzinach i analizowano pod kątem TNF-a. za pomocą testu ELISA. Dane są wyrażone jako średnie. SEM 4 różnych kombinacji dawcy. * Znacząco różni się od wartości dla stymulowanej kontroli; P <0,05. (E) Niedojrzałe DC inkubowano z THP, LPS lub pożywką, i przeprowadzono immunoblotting z lizatów całokomórkowych z użyciem Abs wobec I (B- (3). i ERK-2. (F) THP, LPS lub medium dodano do niedojrzałych ludzkich DC. Oligonukleotydy znakowane 32P, zawierające sekwencję konsensusową NF-kB, inkubowano z ekstraktami jądrowymi, a następnie elektroforezą w żelu nieendenującym. Podobne wyniki uzyskano w 2 niezależnych eksperymentach. (G) Niedojrzałe ludzkie DC preinkubowane z lub bez inhibitora NF-kB SN50 eksponowano na THP, LPS lub pożywkę. Supernatanty pozbawione komórek zbierano po 18 godzinach i analizowano na obecność cytokin metodą ELISA. Dane są reprezentatywne dla 4 niezależnych eksperymentów. * Znacząco różni się od wartości dla stymulowanej kontroli; P <0,05. THP aktywuje szlak sygnalizacji NF-kBy w niedojrzałych DC. Transaktywacja NF-kB jest niezbędna do prawidłowego dojrzewania DC (26). Degradacja I. B-. w DC stymulowanych THP wskazano na aktywację szlaku sygnałowego NF-kBy (figura 4E). Aby bezpośrednio ocenić translokację jądrową NF-kB, przeprowadzono testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) ekstraktów jądrowych. THP indukował translokację NF-kB w sposób zależny od czasu, wykrywając wyraźne sygnały 40 minut po stymulacji (Figura 4F). Hamowanie wytwarzania cytokin przez swoisty inhibitor NF-kB SN50, który ostatnio wykazano, aby zapobiec transaktywacji NF-kB za pośrednictwem LPS w DC (25) dodatkowo potwierdziło te wyniki (Figura 4G). Dane te wskazują, że aktywacja NF-kB jest warunkiem wstępnym pomyślnej aktywacji niedojrzałych DC przez THP. Zaangażowanie TLR4 w immunostymulujące działanie THP. Nakładający się wzór aktywacji osiągnięty przez THP i LPS skłonił nas do oceny możliwej roli szlaku sygnalizacyjnego TLR w efektach immunostymulujących wywieranych przez THP. Tutaj pokazujemy, że kinaza powiązana z receptorem IL-1 (IRAK-1), kinaza serynowo-treoninowa zaangażowana we wczesną aktywację NF-kB pośredniczoną przez TLR (27), została zdegradowana w stymulowanych THP niedojrzałych ludzkich DC w czasie. niezależny sposób (rysunek 5A). Ponadto, selektywne hamowanie TIRAP, krytycznego białka adaptacyjnego w szlaku sygnałowym poniżej TLR1, TLR2, TLR4 i TLR6, ale nie TLR5, TLR7 i TLR9 (28), przez peptyd hamujący TIRAP / Mal, znoszącą indukowaną przez THP cytokinę produkcja w mysich DC (Figura 5B). W celu zbadania roli TLR4 w indukowanej THP aktywacji komórek immunologicznych, ludzkie DC inkubowano wstępnie z anty-TLR4 Ab, mAb HTA-125 i obserwowano znaczne upośledzenie produkcji cytokin (Figura 5C). Wyniki te wskazują na kluczową rolę TLR4 w immunostymulującym oddziaływaniu THP na DC. Figura 5 Włączenie sygnalizacji TLR w aktywacji APC przez THP. (A) Niedojrzałe ludzkie DC inkubowano z THP, LPS lub pożywką, a immunoblotting przeprowadzono z lizatów pełnokomórkowych, stosując przeciwciała przeciw IRAK-1 i ERK-2, które służyły jako kontrola obciążenia. Przedstawiono przedstawiciela 4 niezależnych eksperymentów. (B) Mysie DC pochodzące z szpiku kostnego (BM-DC) traktowano peptydem TIRAP / Mal lub bez niego, a następnie stymulowano THP lub LPS. Po 18 godzinach zebrano supernatanty pozbawione komórek i analizowano za pomocą testu ELISA. (C) Niedojrzałe ludzkie DC traktowano wstępnie mAb przeciwko TLR4 (HTA125) lub kontrolnym mAb przed dodaniem LPS lub THP. Supernatanty pozbawione komórek następnie zebrano i analizowano za pomocą testu ELISA. Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. mDCs, DC pochodzące z monocytów. * Znacząco różni się od wartości dla stymulowanej kontroli; P <0,05. Upośledzone wytwarzanie cytokin po stymulacji THP w MyD88 i zerowym TLR4, ale nie u myszy pozbawionych TLR2 i TLR9. Aby uzyskać bezpośredni dowód aktywacji TLR po zaangażowaniu THP, wyizolowaliśmy makrofagi pochodzące z szpiku kostnego myszy MyD88 i TLR2, TLR4 i TLR9 KO, jak również myszy WT. Podczas gdy THP silnie stymuluje TNF-a produkcja w APC otrzymanych z WT, TLR2a / y i TLR9a /. myszy, komórki z TLR4. /. i MyD88. /. myszy były całkowicie odporne na stymulację THP lub LPS (Figura 6A). Co ważne, komórki szpikowe od TLR4. /. myszy były funkcjonalnie aktywne, ponieważ w pełni zareagowały na agonistę TLR2 Pam3Cys (Figura 6, A i B). Figura 6 Efekt immunomodulacyjny THP wywierany jest przez mechanizm zależny od TLR4 [podobne: profilaktin koncentracja, niedobór witaminy d3 objawy u dorosłych, polana szymoszkowa basen ] [patrz też: ból piszczeli po bieganiu, witamina c lewoskrętna wikipedia, osocze bogatopłytkowe opinie ]