Immunoregulacja wirusowego modelu stwardnienia rozsianego z użyciem syntetycznego kannabinoidu R (+) WIN55,212 ad

Samice myszy SJL w wieku pięciu do sześciu tygodni zakupiono od Harlan Laboratories (Bethesda, Maryland, USA) i umieszczono w Northwestern University Center for Comparative Medicine (Chicago, Illinois, USA). Myszy zakażono przez domózgowe wstrzyknięcie 3 × 107 PFU TMEV typu dzikiego (szczep BeAn 8386) i oceniano w odstępach dziennych w skali klinicznej 0. 5: 0, bez objawów choroby; 1, łagodne zaburzenia chodu; 2, poważne zaburzenia chodu; 3, paraliż w jednej kończynie; 4, więcej niż jedną sparaliżowaną kończynę; 5, konając. Peptydy. Białko proteolipidowe (PLP) PLP139-151 (HSLGKWLGHPDKF) i peptyd TMEV VP270-86 (WTTSQEAFSHIRIPLPH) zakupiono od Peptides International Inc. (Louisville, Kentucky, USA). Kompozycję aminokwasową zweryfikowano za pomocą spektrometrii masowej, a czystość oceniono za pomocą HPLC. Administracja WIN55,212. R (+) WIN55,212 i S (.) WIN55,212 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) rozpuszczono w 10% Tween-80 (Sigma-Aldrich) i PBS do końcowego stężenia 4 mg. / ml lub mg / ml. Mieszaninę następnie zworteksowano i przepuszczono przez igłę 2-gauge. Podobne preparaty bez aktywnych związków zastosowano jako kontrole nośnika. Myszy traktowano dootrzewnowo za pomocą zawiesin (0,1 ml). Grupy myszy zakażonych TMEV (n = 5. 10) traktowano albo wysoką (20 mg / kg) albo niską (5 mg / kg) dawką WIN55,212 na różnych etapach choroby. Reakcja nadwrażliwości typu opóźnionego. Reakcje nadwrażliwości typu późnego (DTH) wywołano przez wstrzyknięcie myszom podskórnie 5 .g peptydów prowokujących, PLP139-151 lub VP270-86, do naprzemiennych uszu po pomiarze grubości ucha za pomocą mikrometru inżynierskiego Mitutoyo model 7326 (Schlesinger . s Tools, Brooklyn, New York, USA). Dwadzieścia cztery godziny po prowokacji peptydem, uszy ponownie mierzono, a różnice w obrzękaniu ucha przed grubością przed prowokacją wyrażono w jednostkach 10 × 4 cale plus SEM. Proliferacja komórek T i analiza cytokin. Śledziony pobierano od zakażonych myszy (n = 2) w różnym czasie po zakażeniu. Proliferację komórek T i analizę cytokin przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (20). Proliferację określono z potrójnych studzienek dla każdego stężenia peptydu, a następnie wyrażono jako. liczy na minutę. Dla IFN-y i analizę cytokin IL-4, duplikat zestawu studzienek do proliferacji użyto do zbierania supernatantów po 48 i 72 godzinach, a stężenia cytokin oznaczono za pomocą testu ELISA. Testy płytek w wirusach. Mózgi usunięto z zakażonych myszy w dniu 7 po dniu leczenia 0. 5 R (+) WIN55,212 lub w dniu 33 po zakażeniu po leczeniu 26. 31 R (+) WIN55,212. Narządy ważono, homogenizowano i rozcieńczano w pożywce DMEM bez surowicy. Testy płytki nazębnej przeprowadzono jak opisano wcześniej (20). Płytki policzono na każdej płytce i pomnożono przez rozcieńczenie i skorygowano pod względem ilości tkanki użytej do nadania wartości jednostkom tworzącym łysinki na miligram tkanki. RT-PCR. Po indukcji TMEV-IDD myszy (n = 2 na punkt czasowy) znieczulono i perfundowano 50 ml PBS. Kręgi kręgowe zostały wytłoczone przez przepłukanie kanału kręgowego PBS. Izolację mRNA z tkanki przeprowadzono jak opisano wcześniej (21). C-RNA pierwszej nici wytworzono z 2 .g całkowitego RNA przy użyciu zestawu Advantage-RT Kit (CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA) stosując starter 20 pmol oligo (dT), zgodnie z dostarczonym przez producenta protokołem, w sumie objętość 20 l. Cytokinową PCR i densytometrię przeprowadzono jak opisano wcześniej (21). Intensywność sumy i pole prążków określono dla każdej pary amplikonów konkurenta / typu dzikiego i określono intensywność dzikiego / konkurenta dla wszystkich cytokin i dostosowano do każdego genu odpowiadającego za utrzymanie próbki, HPRT. Względne poziomy obecnego mRNA mierzono jako procent intensywności kontroli HPRT dla tej próbki. Analiza FACS leukocytów śledziony. Populacje splenocytów wybarwiano stosując antygen sprzężony z anty-CD4, anty-CD8 lub anty-B220-APC, antygen sprzężony z anty-F4 / 80-FITC lub antygen sprzężony z anty-CD4-PerCP i anty-CD25-APC- skoniugowany Ab (PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Komórki znakowano, przemywano, ponownie zawieszano w PBS zawierającym 1% FCS i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej na FACStar (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California, USA). Całkowitą liczbę komórek każdej populacji przeanalizowano indywidualnie z trzech myszy na grupę, a następnie wykreślono jako średnią całkowitą liczbę komórek plus lub minus SEM. Statystyka. Wyniki dotyczące ciężkości klinicznej przedstawiono jako średni wynik kliniczny w grupie i różnica statystyczna obliczona na podstawie testu nieparametrycznego rankingu Manna-Whitneya
[patrz też: olej lniany na odchudzanie, balsam kapucyński ulotka, profilaktin koncentracja ]
[więcej w: odchudzanie roku vita slim opinie, balsam kapucyński ulotka, pompa insulinowa refundacja ]