Komórki dendrytyczne są genetycznie modyfikowane w celu ekspresji hamowania zapalenia stawów indukowanego kolagenem przez IL-4 czesc 4

Komórki śledziony hodowano w 96-studzienkowych płytkach przy gęstości 5 x 106 komórek / ml (200 ul / studzienkę) w LM. Komórki hodowano przez 72 godziny z anty-CD3 (5 ug / ml, 145-2C11) lub przez 96 godzin w samej pożywce lub CII po denaturacji cieplnej (100 ug / ml). Supernatanty z hodowli przechowywano w. 80 ° C do czasu analizy na cytokiny za pomocą testu ELISA. Testy cytokinowe. Mysie IFN-a, IL-2 i IL-4 badano testem ELISA z użyciem sparowanych przeciwciał (BD PharMingen) zgodnie z instrukcjami producenta. Dolne granice wykrywalności wynosiły 40 pg / ml dla IFN-y oraz IL-2 i 10 pg / ml dla IL-4. Miana przeciwciał anty-CII. Miana przeciwciał anty-CII w próbkach surowicy określano za pomocą testu ELISA. Wszystkie próbki zmierzono w dwóch powtórzeniach. Płytki do mikromiareczkowania powlekano 5 ug / ml natywnego CII (klasa ELISA, Chondrex) przez noc w temperaturze 4 ° C, a następnie blokowano przez inkubację z PBS zawierającym 10% FCS. Po przemyciu PBS / 0,05% Tween 20, do dołków dodano 100 .l rozcieńczonych próbek surowicy i płytki inkubowano w 4 ° C przez noc. Płytki przemyto i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z biotynylowaną szczurzą przeciwmysią IgG1 lub IgG2a (BD PharMingen). Płytki przemyto dokładnie i inkubowano z 2,5 .g / ml peroksydazy awidyny (Sigma Chemical Co.) przez 30 minut. Po ostatnim przemyciu płytki opracowano za pomocą ABTS (Sigma Chemical Co.). Gęstości optyczne określono przy 405 nm. Rozcieńczenia pojedynczej próbki surowicy od myszy immunizowanej CII wykorzystano do wygenerowania krzywej standardowej. Analiza statystyczna. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu a2 dla wartości myszy z zapaleniem stawów i kończyn artretyzmu lub testu U Manna-Whitneya dla nasilenia klinicznego i poziomu przeciwciał. Wyniki Transdukcja retrowirusowa DC w celu ekspresji IL-4. Retrowirusowe dostarczanie genów do DC pochodzących z szpiku kostnego uzyskano przez współhodowanie komórek szpiku kostnego z napromieniowanymi liniami komórek produkujących wirusy przez 2 dni, z późniejszym różnicowaniem do DC przez dodatkowe 3 dni w obecności GM-CSF i IL-4. DC wzbogacono przez odwirowanie na gradientach metrizamidu. Ta metoda konsekwentnie generowała populację komórek złożoną z ponad 70% DC, co określono za pomocą analizy immunofenotypowej (MHC klasy II, CD80, CD86, CD11c) (dane nie przedstawione). Na podstawie wyników transdukcji EGFP ponad 90% CD11c + DC zostało pomyślnie transdukowanych (Figura 1a). Aby określić wytwarzanie białka IL-4 przez transdukowane DC, supernatanty DC hodowane przez dodatkowe 24 godziny po wzbogaceniu w gradient metrizamidu zebrano i zbadano na poziom IL-4 przy użyciu ELISA (Figura 1b). Transdukowane DC IL-4P wytwarzały tę cytokinę na poziomie 50 ng / 106 komórek na 24 godziny, podczas gdy IL-4 nie wykryto w supernatantach hodowli pozornie transdukowanych lub transdukowanych EGFP DC. Figura Ekspresja produktów genu transdukowanych retrowirusowo w DC. (a) Analiza metodą cytometrii przepływowej DC z transdukcją EGFP. Komórki barwiono skoniugowanym z PE mAb anty-CD11c lub kontrolą izotypową i analizowano pod kątem ekspresji EGFP i CD11c. (b) wytwarzanie IL-4 przez retrowirusowe transdukowane DC. Stransfekowane Mck, stransdukowane EGFP lub DC transdukowane IL-4 hodowano przez 24 godziny z gęstością 106 / ml, a poziomy IL-4 w supernatantach oznaczano za pomocą ELISA. Dane są średnie. SEM z pięciu niezależnych eksperymentów. Pojedyncze wstrzyknięcie stransdukowanych DC IL-4P hamuje początek i zmniejsza nasilenie CIA. Następnie zbadaliśmy wpływ stransdukowanych DC IL-4P na CIA. We wstępnym doświadczeniu myszy otrzymały iniekcje podskórne o różnej liczbie DC w dniu 19 po immunizacji CII. Stwierdziliśmy, że częstość występowania i nasilenie rozwoju choroby były hamowane przez podawanie 3 × 105 lub 8 × 105 komórek, ale nie przez × 105 komórek (dane nie przedstawione). W oparciu o to odkrycie w kolejnych doświadczeniach zastosowano 3 × 105 DC. Aby określić, czy wpływ DC na CIA różni się w zależności od drogi podawania, myszy otrzymały wstrzyknięcia podskórne, dożylne lub dootrzewnowe 3x 105 transdukowanych DC IL-4P w 15 dniu po immunizacji CII. Zastrzyki DC na każdą drogę podawania hamowały początek i zmniejszały ostrość CIA, ale zapalenie stawów było najskuteczniej hamowane przez wstrzyknięcie dootrzewnowe, następnie wstrzyknięcie dożylne, a w mniejszym stopniu wstrzyknięcie podskórne (Figura 2). Tłumienie rozwoju zapalenia stawów było długotrwałe przez cały czas trwania badania (50 dni po immunizacji CII). Następnie porównaliśmy wpływ dootrzewnowego podawania stransdukowanych DC IL-4P z różnymi kontrolnymi DC (Tabela 1). W przeciwieństwie do pozornego działania hamującego transdukowanych DC IL-4P na CIA, DC nie ulegało modyfikacji w wyniku stransdukcji pozornej lub stransfekowanych EGFP. Figura 2 Wpływ DC transdukowanych IL-4P wstrzykiwanych podskórnie, dożylnie lub dootrzewnowo na częstość występowania (a), średnie odsetki kończyn z zapaleniem stawów (b) i średni wynik kliniczny (c) CIA
[więcej w: badania kontrolne po urlopie macierzyńskim, olej lniany na odchudzanie, szczepionki na meningokoki ]
[więcej w: szczepionki na meningokoki, polana szymoszkowa basen, ile kalorii ma mozzarella ]