Mutacje receptora melanokortyny-4 są częstą i niejednorodną przyczyną chorobliwej otyłości czesc 4

W przypadku przejściowych testów ekspresji lucyferazy, komórki HEK293 kotransfekowano pCRE-luc i dwoma różnymi konstruktami wyrażającymi dzikiego typu lub zmutowanego MC4-R w 6-studzienkowej płytce z użyciem Effectene. Po 24 godzinach komórki z jednego dołka podzielono na 8 studzienek z 48-studzienkowej płytki. Po 48 godzinach po transfekcji przeprowadzono testy lucyferazy i wiązania, jak opisano powyżej dla stabilnie transfekowanych komórek. Analiza genetyczna i fenotypowa rodziny 1417. Panel radiacyjny Genebridge 4 (Research Genetics, Huntsville, Alabama, USA) przeszukiwano parami starterowymi MC4CF / MC4CR i MC4DF / MC4ER stosując takie same warunki, jak w PCR-SSCP. Spośród 93 klonów 29 było pozytywnych, 61 było ujemnych, a 3 niespójne. Dane zostały przesłane do World Wide Web pod adresem http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl w Whitehead Institute (Cambridge, Massachusetts, USA) w celu analizy obliczeniowej i statystycznej. MC4-R zmapowano na mapie ramowej chromosomu 18 w 0cR3000 ze STS WI-4461 (lod> 3). WI-4461 został jednoznacznie przypisany do YAC 938e1 (Whitehead Institute). Fizyczne mapowanie MC4-R do tego YAC (Fondation Jean Dausset, Paryż, Francja) zostało potwierdzone przez PCR. Ponieważ marker mikrosatelity D18S64 również zmapowany do tego samego YAC, użyliśmy tego markera, jak również dwóch sąsiadujących markerów, D18S474 i D18S68, z panelu PE ABI (PE Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) do rodziny genotypów 1417 w locus MC4-R jak opisano (29). Do analizy hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) locus MC4-R w probandzie, oczyszczony YAC 938e1 znakowano biotyną za pomocą translacji nicka (Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy), postępując zgodnie z instrukcjami producenta, i stosowano jako sondę . Test FISH przeprowadzono zgodnie z opisem (30). W skrócie, 100 ng sondy DNA znakowanej biotyną hybrydyzowano z chromosomami i sygnały wykryto za pomocą awidyny skoniugowanej z FITC. Przeanalizowano czterdzieści metafaz. Analizę Southern blot dla MC4-R przeprowadzono zgodnie z opisem (31). Genomowy DNA z probandu i od jednego osobnika kontrolnego trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI, PstI, BstNI i BanII. Sonda obejmowała 600 bp z 5. nieulegający translacji region ludzkiego genu MC4-R. Wyniki Częstotliwość mutacji MC4-R i związek z chorą otyłością u ludzi. Dwustu dziewięciu chorych z otyłością (BMI> 40 kg / m2) poddano badaniom przesiewowym pod kątem mutacji w genie MC4-R za pomocą PCR-SSCP w warunkach opisanych jako wrażliwe na ponad 90% w celu wykrycia podstawień na jednej podstawie (32). Reamplifikacja i bezpośrednie sekwencjonowanie określały sekwencję każdego wykrytego wariantu. Znaleźliśmy 11 różnych wariantów, kodujących dziewięć bzdur, jedną zmianę ramki i jedną cichą mutację (Tabela 1). Każdą mutację potwierdzono przez sekwencjonowanie całej klonowanej sekwencji MC4-R każdego nosiciela mutacji. Testy PCR-RFLP specyficzne dla mutacji zaprojektowano w celu oceny częstości mutacji missense i frameshift u 254 nieobywatelskich kontroli (grupa kontrolna 1). Dwie mutacje missense opisane wcześniej (14, 33), Val103Ile i Ile251Leu zostały znalezione z podobną częstością zarówno w tej grupie kontrolnej, jak iw populacjach otyłych. W żadnej z grup nie zaobserwowano związku tych polimorfizmów z jakimkolwiek fenotypem związanym z otyłością [dane nie przedstawione]. Inne mutacje nie zostały wykryte w grupie kontrolnej 1. Badanie przesiewowe mutacji 1MC4-R u pacjentów z chorobliwie otyłością i kontrolą nieotyną W celu oceny znaczenia wysokiej częstotliwości rzadkich mutacji missense w otyłej kohorcie szukaliśmy obecności rzadkich wariantów w kohorcie 112 nieotyłych bezobjawowych kontroli (grupa kontrolna 2) . Całą sekwencję kodującą MC4-R tych osobników przeszukiwano pod kątem mutacji za pomocą PCR-SSCP. Podczas gdy u 209 otyłych pacjentów wykryto osiem różnych rzadkich mutacji (siedem błędów i nowej mutacji zmiany ramek), nie wykryto dodatkowych niepolimorficznych mutacji w 112 grupach kontrolnych. Tabela podsumowuje sekwencję i częstotliwości wariantów znajdujących się w trzech różnych kohortach. Podsumowując, nasze wyniki wskazują na związek rzadkich mutacji w MC4-R z chorobliwą otyłością (P = 0,03, dokładny test Fishera). Funkcjonalna heterogenność mutacji missense MC4-R związanych z otyłością człowieka. Zbadaliśmy patogenną rolę mutacji missense znalezionych w chorobliwie otyłej kohorcie, porównując aktywność różnych zmutowanych MC4-R z aktywnością receptora typu dzikiego. Receptory typu dzikiego i wszystkie zmutowane klonowano, eksprymowano w komórkach HEK 293 i porównywano ich zdolność do wiązania i aktywacji przez ich naturalnego agonistę a-MSH. Zależny od cAMP test lucyferazy zastosowano do globalnej oceny aktywności sprzężonego z Gs MC4-R w stabilnie transfekowanych komórkach wyrażających równoważne ilości receptora. W tym teście zarówno MC4-R typu dzikiego, jak i MC4-R zawierające zmianę polimorficznego aminokwasu Ile251Leu wykazywały podobną krzywą zależności dawka-odpowiedź (Figura 1a).
[podobne: depilacja laserowa twarzy, ból piszczeli po bieganiu, laserowe wybielanie zębów cena ]
[przypisy: osocze bogatopłytkowe opinie, tomaszowskie centrum zdrowia, olej lniany na odchudzanie ]