Mutacje w ludzkim genie SC4MOL kodującym oksydazę sterolową powodują łuszczycowe zapalenie skóry, małogłowie i opóźnienie rozwojowe ad 8

Próbki kontrolne stosowane do genotypowania nowych wariantów uzyskano z inicjatywy National Genetic of Human Genetics Initiative. Wszystkie kontrole (1 452 próbki) stanowiły dorosłe samce pochodzenia europejskiego, które poddano badaniom przesiewowym w celu wykluczenia zaburzeń psychicznych. Ponadto na każdej badanej płytce uwzględniono również pozytywne kontrole i ujemne kontrole wodne. Genotypowanie przeprowadzono za pomocą niestandardowego testu genotypowania TaqMan SNP z Applied Biosystems zgodnie z instrukcjami producenta. Startery i sondy zaprojektowano zgodnie z Custom Custom TaqMan SNP Genotyping Assay Protocol (Applied Biosystems). W przypadku wariantu 519T A (H173Q) użytymi starterami amplifikacji był 5 (3 -TCTGCATAGACTCTTACACCACAAAAG-3. (do przodu) i 5-GCCTCTAACAGAAAGAATTAAATATAACTCTCACA-3. (rewers). Zastosowane sondy reporterowe specyficzne dla fluoroforu obejmują 5 -CTGAAACTCATGATGAACTT-3. (VIC) i 5. -TGAAACTCATGTTGAACTT-3. (FAM). W przypadku wariantu 731A (G2 (Y224C) zastosowano startery do amplifikacji 5 (3 -ATATTCCTCTCAACCCTTTAAATCTGATCC-3. (forward) i 5. -TCCAATGAAGTTCATGTGGTGGAAA-3. (rewers). Zastosowane sondy reporterowe znakowane fluoroforem specyficzne dla allelu obejmowały 5PAGAAKCAGCATAGAAAG-3. (VIC) i 5a-AACCAGCACAGAAAG-3. (FAM). Testy przeprowadzono na 384-studzienkowych płytkach, a końcowa objętość reakcji wynosiła 5 ul, składała się z 5 ng genomowego DNA, 2,5 ul TaqMan Master Mix i 0,06 ul 40 x mieszanki testowej. Warunki cyklu termicznego wynosiły 50 ° C przez 2 minuty, 95 ° C przez 10 minut i 45 cykli w 92 ° C przez 15 sekund i 58 ° C przez minutę. Po zakończeniu PCR płytki odczytano na detektorze sekwencji ABI PRISM 7900 HT. Genotypy zostały nazwane z powodzeniem dla 1438 próbek w obu wariantach przy użyciu oprogramowania Allelic Discrimination Sequence Detection Software (Applied Biosystems) wersja 2.3 (SDS v2.3). Analizy sterolowe. Dystrybucja steroli była mierzona w hodowlach fibroblastów skóry, transformowanych limfocytach, surowicy i płatkach skóry otrzymanych od pacjentów i kontrolnych za pomocą chromatografii gazowej i wybranej spektrometrii mas jonów jak opisano poprzednio (7, 44). Cytometria przepływowa na krwinkach obwodowych. Przeprowadzono cytometrię przepływową na komórkach od pacjentów i kontroli i analizowano jak opisano wcześniej (19). W badaniach hamowania oksydazy sterolowej, 10 ml krwi pełnej pozbawionej krwinek czerwonych z zdrowej 16-letniej dziewczynki inkubowano z 5 mM ATZ przez 60 godzin w 37 ° C z 5% CO2. Zarówno leukocyty leczone ATZ, jak i nietraktowane zostały następnie wyizolowane i zabarwione jak opisano w Tabeli dodatkowej 2. Oznaczenie ilościowe cytokin w surowicy. Poziomy cytokin określano za pomocą testu multipleksowego z zastosowaniem układu Luminex (Luminex Corp.), jak opisano poprzednio (45, 46). Hodowla komórek, proliferacja i ELISA. Pierwotne fibroblasty skóry hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 100 U / ml penicyliny i 100 mg / ml streptomycyny; GlutaMAX (Invitrogen), TNF-a (10 ng / ml) i simwastatynę (5 uM) dodano do fibroblastów przy 80% konfluencji; pożywki hodowlane zbierano po 24 godzinach do pomiaru IL-6 przy użyciu zestawu ELISA (BD). W testach proliferacji komórek, pierwotne fibroblasty lub transformowane EBV ludzkie limfoblasty hodowano z pożywką zubożoną w cholesterol, jak opisano (44), w którym stan syntezy de novo cholesterolu został aktywowany i utrzymany (Tabela dodatkowa 5); i ATZ (2 mM), symwastatynę (5 (M) lub flukonazol (12,5. M) dodano do podłoża przed poddaniem komórek testowi proliferacji. Analiza proliferacji komórek i etapów cyklu komórkowego. Fibroblasty skóry lub transformowany EBV limfoblast (2 x 107 komórek / ml) znakowano 5 (i 6) CFSE (0,25 (M) (Molecular Probes, Invitrogen) stosując ustalone procedury (19). W różnych dniach hodowli komórki zebrano i wybarwiono DAPI. Intensywność fluorescencji zarówno CFSE, jak i DAPI analizowano za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej. Liczbę podziałów komórkowych określono na podstawie liczby pików fluorescencji CFSE. Liczba komórek w fazach G0-G1 i S-G2-M w cyklu komórkowym była proporcjonalna do ilości liniowej fluorescencji DAPI, komórki G0-G1 mające połowę ilości wybarwienia DAPI jako komórki S-G2-M. Statystyka
[patrz też: centrum onkologii warszawa roentgena, tomaszowskie centrum zdrowia, laserowe wybielanie zębów cena ]
[przypisy: ile kalorii ma mozzarella, profilaktin koncentracja, paznokcie w kształcie migdałów ]