Regulacyjna rola DR4 w spontanicznym modelu transgenicznym cukrzycy DQ8 ad 6

Supernatanty z hodowli następnie testowano pod kątem wytwarzania IFN-y. i IL-4 z zastosowaniem testu ELISA. Przebadaliśmy także inną kohortę kontroli mII. myszy, które eksprymują DQ8 lub DR4 lub oba (DQ8DR4), ale bez ekspresji transgenu RIP-B7. Żadne limfocyty T CD4 + z żadnej z grup nie wykazywały znaczących odpowiedzi proliferacyjnych na GAD ani insulinę (dane nie pokazane), a wytwarzanie cytokin (IFN-y i IL-4) było tylko nieznacznie powyżej poziomów wykrywania (Figura 6a). Jednak stymulacja anty-CD3 napędzała wytwarzanie zarówno IFN-y jak i IFN-y. i IL-4 przez te limfocyty T CD4 + (Figura 6b) i profil IFN-y lub IL-4 była podobna do obserwowanej u myszy eksprymujących transgen RIP-B7 (Figura 6b). Wszystkie eksperymenty pokazane powyżej powtórzono stosując całkowite komórki T (CD4 + i CD8 +) i otrzymano bardzo podobne wyniki (dane nie przedstawione). Sugeruje to, że wpływ DR4 na odpowiedź immunologiczną typu Th2 jest ograniczony do komórek T CD4 + u tych myszy. W celu zidentyfikowania epitopów komórek T dających spontaniczną odpowiedź GAD u myszy DQ8 + DR4 + / mIIa / RIP-B7.1, przetestowaliśmy sześć peptydów GAD (GAD 61-80, 201-220, 281-300, 247-266, 509-528 i 524-543). Jednak żaden z tych peptydów nie wytworzył znaczącej reaktywności komórek T ani w testach proliferacji ani produkcji cytokin. Peptydy antygenowe rozpoznawane przez komórki T CD4 + pozostają do ustalenia. Nie było spontanicznych odpowiedzi na IA-2, inny dobrze scharakteryzowany autoantygen komórek beta. Ekspresja DR4 może powodować różnicowanie komórek T CD4 w kierunku fenotypu Th2. Aby potwierdzić wytwarzanie cytokin w odpowiedzi na autoantygeny, stymulowaliśmy limfocyty T CD4 + z DQ8 + / mII p / RIP-B7.1, DR4 + / mll P / RIP-B7.1 lub DQ8 + DR4 + / mII p / RIP-B7. .1 myszy z anty-CD3, które indukują maksymalną stymulację komórek T. Supernatanty zebrano po 48 godzinach i testowano na produkcję cytokin (IFN-a, IL-4, IL-6). Jak pokazano na Figurze 6b, komórki T CD4 + z myszy DQ8 + / mllp / RIP-B7.1 wydzielały wysoki poziom IFN-y. i względnie niski poziom IL-4, podczas gdy ekspresja DR4 (samodzielnie lub razem z DQ8) odwracała ten wzór wytwarzania cytokin. Wytwarzanie IL-6 można było wykryć, choć na niskim poziomie, w supernatantach stymulowanych komórek T CD4 + od myszy eksprymujących DR4 (sam lub razem z DQ8), natomiast było niewykrywalne w supernatancie stymulowanych komórek T CD4 + z DQ8 + myszy /mII./RIP-B7.1 (dane nie pokazane). Chemokiny to cytokiny chemotaktyczne, a oddziaływanie chemokin i ich receptorów jest ważne zarówno dla odpowiedzi immunologicznej pierwotnej, jak i wtórnej (pamięci). Wykazano, że pewne receptory chemokin, takie jak CCR5, CXCR3 i CCR1, są preferencyjnie eksprymowane w komórkach Th1 (42. 45). W celu zbadania, czy obniżenie poziomu endogennej odpowiedzi immunologicznej Th1 poprzez ekspresję DR4 wpływa również na ekspresję receptora chemokin, zbadano poziomy mRNA dla CCR5 i CCR2 na komórkach T CD4 + aktywowanych anty CD3 + z DQ8 + DR4 + / mIIy / RIP- Myszy B7.1 i DQ8 + / mIIa / RIP-B7.1. Chociaż nie jest to ilościowy test PCR w czasie rzeczywistym, użyliśmy CD3. jako kontrola wewnętrzna dla normalizacji poziomów RNA badanych próbek (rysunek 7). Ekspresja CCR5, ale nie CCR2 była obniżona w komórkach T CD4 + od myszy DQ8 + DR4 + / mII P / RIP-B7.1, co dodatkowo potwierdziło, że ekspresja DR4 promuje endogenne odpowiedzi immunologiczne podobne do Th2 i obniża endogenne odpowiedzi immunologiczne Th1. (Rysunek 7). Figura 7: Ekspresja mRNA chemokin CCR5 i CCR2. Ekspresję chemokin CR5 i mRNA CCR2 oceniano za pomocą RT-PCR (patrz Metody), jak pokazano na żelu barwionym bromkiem etydyny. CD3. był stosowany jako kontrola wewnętrzna dla normalizacji poziomów RNA badanych próbek, jak wskazano. Ścieżka 1: drabina o 100 bp; ścieżki 2. 5: CCR5 lub CCR2, jak pokazano. RT-PCR przeprowadzono na cDNA z syntezą oligo-dTT, który pochodził z całkowitego RNA stymulowanych anty-CD3 (3 komórek śledziony myszy bez cukrzycy, jak wskazano. Aby ustalić, czy skłonność do odpowiedzi Th2 związanych z ekspresją DR4 w badaniach in vitro jest również prawdziwa in vivo, zbadaliśmy izotypy Ig w surowicy w DQ8 + / mII p / RIP-B7.1, DR4 + / mII p / RIP-B7.1, i myszy DQ8 + DR4 + / mIIa / RIP-B7.1. Zasadniczo stosunek między IgG1 i IgG2a jest stosowany jako marker statusu Th2 / Th1. Jednak dla niektórych szczepów myszy, takich jak C57BL / 6, C57BL / 10 i NOD, ten marker może nie być najbardziej odpowiedni do tego celu, ponieważ doniesiono, że w tych mysich plamach występuje delecja w genie kodującym IgG2a ( 46). Te szczepy myszy eksprymują izotyp nazwany IgG2c (47, 48). Niestety nie ma dostępnych odpowiednich odczynników do wykrywania IgG2c
[przypisy: rak płaskonabłonkowy płuca, kamikadze, olej lniany na odchudzanie ]
[patrz też: tomaszowskie centrum zdrowia, olej lniany na odchudzanie, niedobór witaminy d3 objawy u dorosłych ]