Regulacyjna rola DR4 w spontanicznym modelu transgenicznym cukrzycy DQ8 ad

W żadnym przypadku te transgeniczne myszy (HLA-DQ8 i / lub HLA-DR4) nie rozwijały się spontanicznie, nawet jeśli ulegały ekspresji na podłożu genetycznym NOD (32). Aby zbadać, czy możemy przełamać tolerancję wykazywaną przez transgeniczne myszy HLA-DQ8 i HLA-DR4, które nie były na podłożu genetycznym NOD, dostarczając lokalnie sygnał kostymulujący B7-1, wprowadziliśmy tę kostymulującą cząsteczkę przy użyciu szczurzego promotora insuliny ( ROZERWAĆ). Sam transgen RIP-B7.1 normalnie nie powoduje cukrzycy na podłożu genetycznym C57BL / 6 (33). Jednakże, donieśliśmy, że ekspresja DQ8, w której zlikwidowano mysią MHC klasy II, sprowokowała autoimmunologiczną cukrzycę u większości nie podatnych na cukrzycę myszy RIP-B7.1 C57BL / 6 (34). W tym badaniu porównaliśmy wpływ DQ8 z wpływem DR4, samodzielnie lub w połączeniu, na rozwój choroby. Naszym celem było wykorzystanie tego. Humanizowanego. spontaniczny system modelowania cukrzycy w celu zbadania względnego efektu immunopatologicznego pojedynczych genów podatności na cukrzycę w silnym braku sprzężenia. Nowe informacje dotyczące roli DR4 w rozwoju choroby są ważne dla klinicznego rozwoju skutecznej immunoterapii, zwłaszcza z uwagi na fakt, że geny HLA DQ8 / DR4 powszechnie występują u pacjentów z cukrzycą. Sposoby Wytwarzanie transgenicznych myszy DR4 + / mIIa / RIP-B7.1 i DQ8 + DR4 + / mlla / RIP-B7.1. HLA-DQA1 * 0301 / DQB1 * 0302 (DQ8) transgeniczne, mysie myszy z niedoborem cząsteczki mysiego MHC klasy II (mll.) I RIP-B7.1 C57BL / 6 wytworzono jak opisano wcześniej (34). Myszy transgeniczne HLA-DRA1 * 0101 / DRB1 * 0401 (DR4) (B10) zostały dostarczone przez Wicker i Zaller (Merck & Co. Inc., Rahway, New Jersey, USA) (35). Po krzyżowaniu krzyżowym tych myszy z genem C57BL / 6 (N4 do N5), wprowadziliśmy rozbitą mysią cząsteczkę MHC klasy II (mll.) I B7.1 na trzustce. komórki (DR4 + / mII P / RIP-B7.1), zarówno na tle C57BL / 6. Następnie krzyżowaliśmy myszy DQ8 + / mIIa / RIP-B7.1 z myszami DR4 + / mIIa / RIP-B7.1 w celu otrzymania myszy DQ8 + DR4 + / mIIa / RIP-B7.1 i wszystkich różnych typów myszy kontrolnych. . Ekspresję transgenu DQ8 i / lub DR4 i mysich cząsteczek I-Ab klasy II badano metodą cytometrii przepływowej limfocytów krwi obwodowej (PBL), a transgen RIP-B7.1 badano przesiewowo za pomocą PCR (34). Wszystkie myszy użyte w tym badaniu były kociętami z miotu. Jak wspomniano powyżej, wszystkie różne typy myszy kontrolnych, takie jak DQ8 + DR4 + / mIIa / RIP-B7.1a, DQ8 + / mIIa / RIPB7.1a, DR4 + / mIIa / RIP-B7.1 ., mllP / RIP-B7.1+, i mll + / RIP-B7.1 +, uzyskano z tych samych par do hodowli. Możliwość, że transgeniczne myszy wyrażały hybrydy IAA / DQ8. i DR4. / IE. został wykluczony przez negatywne barwienie PBL specyficznymi mAb. dla IA. b (AF6-120,1, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA) i IE (Y17, Charlie Janeway), odpowiednio. Aby ustalić tło genetyczne C57BL / 6 myszy użytych w tym badaniu, przebadaliśmy również markery genomowe u tych myszy przy użyciu analizy mikrosatelitarnej. Do skriningu użyto siedemnastu markerów: idd 2 do idd 15 (36) i trzy dodatkowe markery (D1Mit232, D1Mit22 i D7Nds6), o których doniesiono, że są związane z cukrzycą na podłożu genetycznym C57BL / 6 (37). Myszy przechowywano w obiektach wolnych od patogenów i wszystkie eksperymenty prowadzono zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Yale Animal Care and Use Committee. Oczyszczanie limfocytów T CD4 +. Po usunięciu erytrocytów, całkowite splenocyty inkubowano z mAb anty-CD8 (TIB-105, szczurzy IgG2a) na lodzie przez 30 minut i przemyto jednokrotnie zimnym medium Click. Następnie komórki inkubowano z kulkami magnetycznymi skoniugowanymi z kozim anty-mysim IgG / IgM i kozim anty-szczurzym IgG (PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts, USA) na lodzie z delikatnym mieszaniem przez 45 minut. Komórki B i komórki CD8 + usunięto za pomocą płytki magnetycznej (PerSeptive Biosystems). Czystość populacji CD4 + za pomocą tej metody wynosi rutynowo ponad 90%. Testy proliferacji i cytokin. Komórki T śledziony (105 / studzienkę) od myszy z cukrzycą lub bez cukrzycy badano pod kątem odpowiedzi antygenowej przeciwko trzem głównym domniemanym autoantygenom komórek. GAD (30), insulina (Eli Lilly and Co., Indianapolis, Indiana, USA) i IA-2 (uprzejmie dostarczone przez Petera van Enderta, Hôpital Necker, Paryż, Francja), jak opisano wcześniej. Wydzielone białka cytokinowe (IL-4, IL-6, IL-10 i IFN-a) z tych odpowiedzi zmierzono za pomocą ELISA stosując mAbs i zalecane protokoły (PharMingen). Eksperymenty z przeniesieniem adopcji. Myszy użyte do tych doświadczeń napromieniowano (6 Gy) na jeden dzień przed adopcyjnym przeniesieniem. Splenocyty cukrzycowe wstrzyknięto dożylnie biorcom (107 / biorca)
[przypisy: balsam kapucyński ulotka, rak płaskonabłonkowy płuca, olej lniany na odchudzanie ]
[więcej w: pompa insulinowa refundacja, depilacja laserowa twarzy, badania kontrolne po urlopie macierzyńskim ]