Regulacyjna rola DR4 w spontanicznym modelu transgenicznym cukrzycy DQ8 cd

Wszystkie myszy monitorowano pod kątem glikozurii, a eksperymenty zakończono 8 tygodni po adopcyjnym przeniesieniu, chyba że u myszy rozwinęła się cukrzyca, co zostało potwierdzone przez stężenie glukozy we krwi (> 250 mg / dl) i natychmiast uśmiercano je. Generacja chimery szpiku kostnego. Myszy MIIa / RIP-B7.1 zostały użyte jako biorcy w eksperymencie chimerycznym i zostały napromieniowane (8,5 Gy) dzień przed rekonstytucją szpiku kostnego (BM). Nasze wstępne badanie chimery BM wykazało wysoką śmiertelność wśród biorców, którzy otrzymali napromienianie ponad 9 Gy. Może to wynikać z faktu, że biorcy mają niedobór MHC klasy II i dlatego są odporni na upośledzenie odporności. Komórki BM zebrano od myszy bezdiabetycznych myszy DQ8 + / mIIa / RIP-B7.1, DR4 + / mllp / RIP-B7.1 i DQ8 + DR4 + / mIIa / RIP-B7.1 (8-12 tygodni życia) wstrzyknięto dożylnie biorcom (107 / biorca). Wszystkie myszy monitorowano pod kątem glikozurii i eksperymenty zakończono 8 tygodni po adopcyjnym przeniesieniu, chyba że u myszy rozwinęła się cukrzyca, co zostało potwierdzone przez glukozę we krwi, i natychmiast uśmiercano je. RT-PCR do wykrywania ekspresji receptorów chemokin. Oczyszczone limfocyty T CD4 + (2 x 106) z myszy DQ8 + DR4 + / mIIa / RIP-B7.1 i DQ8 + / mIIa / RIP-B7.1 aktywowano przez sieciowanie anty-CD3 (24 godziny) i całkowitą komórkowe RNA wyizolowano za pomocą Trizol (Life Technologies Inc., Grand Island, Nowy Jork, USA). CDNA zsyntetyzowano stosując starter oligo-dT (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, New Jersey, USA), który rozpoznaje ogon poli (A) mRNA. PCR przeprowadzono przy użyciu specyficznych starterów dla mysiego CCR5 i CCR2 i tej samej ilości matryc cDNA. Do PCR wykorzystano standardowe warunki, a do normalizacji poziomów RNA zastosowano kontrolę wewnętrzną, CD3 (3. Test izotypu Ig. Pobrano próbki krwi i surowicę oddzielono po zakończeniu eksperymentów. Poziomy izotypów Ig mierzono za pomocą testu ELISA, jak opisano wcześniej (38). Wszystkie odczynniki do tego testu zakupiono od Southern Biotechnology Associates (Birmingham, Alabama, USA). Immunohistologia. Trzustki, nerki, wątroby i gruczoły ślinowe wszystkich myszy użytych w tym badaniu badano za pomocą immunohistochemii, jak opisano wcześniej (39). Wyniki Ekspresja DR4-pojedynczego i podwójnych transgenów DQ8 / DR4 u myszy pozbawionych endogennych mysich cząsteczek MHC klasy II. Wykazaliśmy ostatnio, że myszy DQ8 + / mIIa / RIP-B7.1 C57BL / 6 wykazują dużą częstość występowania spontanicznej cukrzycy (34). W niniejszym badaniu wygenerowaliśmy DR4 + / mII. myszy, ponieważ najczęstszy haplotyp zaobserwowany u pacjentów z T1DM zawiera DR4 i DQ8. Jak pokazano na Figurze 1, ekspresja transgenu HLA-DR4 u myszy z niedoborem mysich cząsteczek MHC klasy II częściowo przywróciła komórki T CD4 + do poziomu podobnego do tego w DQ8 + / mII. myszy transgeniczne. Zmienna TCR. łańcuchowy (V.) repertuar DR4 + / mII. myszy nie wykazały znaczących różnic w porównaniu z myszami typu dzikiego (MHC klasy II wystarczającej) (C57BL / 6), z tym wyjątkiem, że całkowita liczba komórek T CD4 + była mniejsza (w przybliżeniu 25% wszystkich komórek T). Tak było również w przypadku DQ8 + / mII. myszy (30). Więcej komórek T CD4 + (około dwukrotnych) zostało wybranych u myszy wyrażających zarówno DQ8 i DR4 (Figura 1), jak również, że koekspresja DQ8 i DR4 nie wydawała się przekrzywić TCR V. repertuar (dane nie przedstawione). Poziom ekspresji DQ8 i DR4 w DQ8 + DR4 + / mII. myszy były nie do odróżnienia, ani DR4 + / mII. ani DQ8 + DR4 + / mII. myszy (podobnie jak ich odpowiedniki DQ8 + / mIIa) rozwinęły spontaniczne zapalenie wyrostka lub cukrzycę w okresie 10 miesięcy. obserwacja (dane nie pokazane). Figura Ekspresja transgenów HLA i selekcja komórek T CD4 +. W górnym panelu limfocyty wyizolowane z krwi obwodowej u trzech typów myszy (jak wskazano) wybarwiono markerem komórek B B220 (fikoerytryna, PE) w połączeniu z anty-HLA-DQ (FITC) lub DR (FITC) . W środkowym panelu izolowano tymocyty z myszy w wieku 5. 7 tygodni i barwiono je przeciwciałem anty-CD4 (PE; y) i anty-CD8 (oś FITC; x). Bramkowane jednojądrzaste tymocyty CD4 stanowiły 5,2%, 5% i 9,8% wszystkich tymocytów analizowanych w DQ8 + / mllp / RIP-B7, DR4 + / mllp / RIP-B7 i DQ8 + DR4 + / mIIa / RIP-B7. myszy, odpowiednio. W dolnym panelu splenocyty (po usunięciu erytrocytów) wybarwiono anty-CD4 (PE) i anty-CD8 (FITC). Bramkowane splenocyty jedno-dodatnie CD4 stanowiły 11,4%, 11,8% i 19,5% wszystkich splenocytów analizowanych w DQ8 + / mllp / RIP-B7, DR4 + / mllp / RIP-B7 i DQ8 + DR4 + / mllp / RIP-B7. myszy, odpowiednio. Występowanie spontanicznej cukrzycy u myszy DR4 + / mIIa / RIP-B7.1 i DQ8 + / mIIa / RIP-B7.1 i u myszy koeksprymujących DR4 i DQ8
[więcej w: polana szymoszkowa basen, ból piszczeli po bieganiu, centrum onkologii warszawa roentgena ]
[przypisy: laserowe wybielanie zębów cena, szczepionki na meningokoki, polana szymoszkowa basen ]