Sieć zależna od kwasu retinowego w przednim obiegu kontroluje tworzenie mysiego płuca ad 8

Zarodki zostały odróżnione od ich miotów z cechami fenotypowymi i genotypowania PCR (7). Aktywację szlaku RA wykrywano za pomocą myszy reporterowych RARElacZ (31). Kanoniczna sygnalizacja Wnt została wykryta przy użyciu myszy reporterowej BATgal, reportera opartego na promotorze TCF-lacZ (15). Myszy Rarelh2 + /. RARElacZ wytworzono przez skrzyżowanie Raldh2 + /. myszy (dostarczone przez P. Dollé, Institute of Genetics and Molecular and Cell Biology, Illkirch, France) i myszy RARElacZ (dostarczone przez J. Rossanta, University of Toronto, Toronto, Ontario, Kanada). Następnie potomstwo kojarzone było z innym Raldh2 + /. mysz do generowania zarodków Raldh2. / RARElacZ. Podobnie, myszy Raldh2 + /. BATgal wytworzono przez skrzyżowanie 2 odpowiednich linii, które ponownie skrzyżowano z Raldh2a /. myszy do generowania zarodków Raldh2. / BATgal do analizy. Barwienie X-gal zastosowano do wizualizacji ekspresji lacZ we wszystkich liniach reporterowych (10). Wszystkie zastosowane protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Bostońskiego. Przedgonowe kultury eksplantacyjne. System hodowli przedniego jelita został opisany wcześniej (8). W skrócie, komórki typu foreguts wyizolowano z zarodków E8.5 (8S. 12S) i hodowano przez 72 godziny (o ile nie podano inaczej) w 37 ° C, 95% powietrza i 5% CO2, na 6-dołkowych naczyniach Transwell-Col (Fisher Scientific ) zawierającej 1,5 ml pożywki BGJb (Invitrogen), 0,3 mg witaminy C (Sigma-Aldrich) i 10% płodowej surowicy cielęcej (Invitrogen) z lub bez specyficznych modulatorów sygnalizacji RA, Tgfp lub Wnt (patrz poniżej). Media były zmieniane codziennie. W niektórych doświadczeniach, szczepy heparyny namoczone w ludzkim rekombinowanym FGF10 (100 ng / ml, systemy R & D), rekombinowane mysie Wnt3a (1 (jg / ml, systemy R & D) lub PBS (Invitrogen) wszczepiono na przedni worek. Dla wszystkich eksperymentów wnioski oparto na ocenie co najmniej 3 niezależnych osobników na warunki hodowli. Modulacja RA, Wnt i Tgf. sygnalizacja. BMS (10. 6 M, dostarczony przez C. Zusi, Bristol-Myers-Squibb, Wallingford, Connecticut, USA), antagonistę receptora panA RA, zastosowano do antagonizowania sygnalizacji zależnej od receptora RA (40). All-trans RA (10. 7 M, Sigma-Aldrich) użyto do ratowania sygnalizacji RA w Raldh2. /. foreguts. Tgf. antagonistę receptora SB431542 (10 (M, Sigma-Aldrich) lub specyficzne dla pnia przeciwciało blokujące TGF (200. g / ml; R & D Systems) rozpuszczone w pożywce zastosowano do hamowania Tgf. sygnalizacja (10, 22, 23). Rekombinowana mysz Dkk1 (400 ng / ml; R & D Systems) lub kwercetyna (10 (M, Sigma-Aldrich) zastosowano do hamowania kanonicznej sygnalizacji Wnt (21, 41) i kulki heparyny moczone w inhibitorze Gsk3b SB216763 (10 (M; Sigma-Aldrich) lub Wnt3a (1000 ng / ml; R & D Systems) użyto do aktywacji kanonicznej sygnalizacji Wnt (42). MLG hodowla komórkowa i PCR w czasie rzeczywistym. Myszowe komórki nowonarodzone MLG hodowano w DMEM z lub bez all-trans RA (10. 6 M) przez 24 godziny. Wyizolowano całkowity RNA (TRIzol; Invitrogen), odwrotną transkrypcję (1.g RNA, Super Strand III First Strand; Qiagen) i zamplifikowano metodą PCR w czasie rzeczywistym (Taqman sond, Applied Biosystems). Zastosowano krzywą dysocjacji w celu określenia względnego stężenia pojedynczego produktu PCR; Mono-pektyny (Actb) RNA zastosowano do normalizacji. Ilościowa reakcja PCR z eksplantatów na foregut w czasie rzeczywistym. Pierwiastki zebrano po 24 godzinach w hodowli. Serce, przednie i tylne trzecie eksplantatów oddzielono i odrzucono. Całkowity RNA z midforeguts izolowano przy użyciu RNeasy (Qiagen), odwrotnej transkrypcji (SensiScript; Qiagen) i amplifikowano metodą PCR w czasie rzeczywistym (TaqMan sond, Applied Biosystems). Poziom RNA wiadomości Actb został wykorzystany do kontroli wewnętrznej. Konstrukcje plazmidowe i ukierunkowana mutageneza. Fragmenty genomowe składające się z ~ 1,212 bp z miejsca początkowego translacji 5. region mysiego genu Dkk1 wytworzono przez amplifikację PCR. Fragmenty wklonowano w miejsca KpnI i XhoI podstawowego wektora pGL3 (pGLc basic; Promega). Konstrukty zostały zweryfikowane przez sekwencjonowanie. Przybliżony mysi promotor Dkk1 o wielkości 1,2 kb – konstrukt lucyferazy, zawierający. 1,212 pz mysiego fragmentu promotorowego Dkk1, zastosowano jako matrycę dla mutacji przypuszczalnego RAR. miejsce wiązania (QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene), zgodnie z protokołami producenta. Mutację miejsca wiązania potwierdzono przez sekwencjonowanie. Kotransfekcja i test lucyferazy. Komórki MLg hodowano z początkową gęstością 1,5 x 105 komórek / studzienkę w 6-studzienkowych płytkach. WT i zmutowany około 1,2-kb mysi promotor Dkk1-konstrukt lucyferazy (2 ug) i konstrukty renilla (6 ng) kotransfekowano do komórek MLg metodą DEAE-dekstran / chlorochina, jak opisano poprzednio (43).
[podobne: badania kontrolne po urlopie macierzyńskim, rak płaskonabłonkowy płuca, balsam kapucyński ulotka ]
[więcej w: osocze bogatopłytkowe opinie, tomaszowskie centrum zdrowia, olej lniany na odchudzanie ]