Sieć zależna od kwasu retinowego w przednim obiegu kontroluje tworzenie mysiego płuca ad

W poprzedniej próbie zbadania molekularnych mechanizmów agenezji płuc, przeanalizowaliśmy globalne profile transkrypcyjne mysich zarodkowych przodków z farmakologicznego i genetycznego modelu niedoboru RA. Próbki z deficytem RA składały się z przednich wlotów E8.5 WT hodowanych przez 24 godziny z antagonistą receptora RA BMS493 (określanym w niniejszym dokumencie jako BMS) lub z wymazem E58 Raldh2 z zerami hodowanymi w pożywce kontrolnej; oba wykazywały agenezję płuc. Próbki dostatecznie RA były kontrolnymi WT lub Ruthh2-NULL, w których formowanie płuc zostało uratowane przez egzogenny RA (7. 9, 11). Spośród genów ulegających zróżnicowanej ekspresji odkryliśmy, że Dkk1, endogenny antagonista sygnalizacyjny Wnt, był znacząco podwyższony w niedoborach RA z obu modeli (model BMS, 3,5-krotny, P = 1,46 × 10. 9, model zerowy Raldh2, 2,8 -fold, P = 1,95 x 10 8). Aby potwierdzić tę obserwację, ocenialiśmy ekspresję Dkk1 za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w przedrakach z niedoborem RA i w stopniu wystarczającym dla RA i stwierdziliśmy wysoce statystycznie znaczący wzrost poziomów mRNA Dkk1 w traktowanych BMS w porównaniu z nieleczonymi wcześniejszymi wyjściami kontrolnymi (P = 0,002; 1A). Zgodnie z tym obserwowaliśmy również dramatyczny wzrost poziomu Dkk1 w przedrodzinach z Raldh2 w porównaniu z odpowiednimi zerowymi dziobami uratowanymi przez egzogenną RA (P = 0,0005). Figura 1Dkk1 jest celem RA na początku morfogenezy płuc. (A) Real-time PCR. Zwiększenie poziomu Dkk1 w przedrakach z niedoborem RA (traktowany BMS WT i nieukierunkowany Raldh2 (3 /.) W porównaniu z odpowiednimi kontrolami (Ctr). (B i C) Dkk1 ISH w WT i Raldh2. /. zarodki (12S, góra) utrwalone koimmunologicznie Sox2 (na dole), przedstawiające (B) brak sygnałów Dkk1 w przednim jelicie (Fg, obszary pudełkowe) zarodka WT i (C) silne Dkk1 (niebieskie groty strzałek) w obu endodermach (czerwone groty strzał, Sox2 -znaczone brązowe jądra) i mezodermy Raldh2. /. zarodek. Oryginalne powiększenie, × 10 (góra); × 100 (dół). (D. I) Wzajemny wzór ekspresji Dkk1 (D. F, WMISH) i aktywności RARElacZ (G. I) w przednim jelicie, głowie i ogonie (strzałki) w wystarczającym RA (D i G, 16S. 18S; i H, 11S212S) i zarodki z niedoborem RA (F i I, 11S212S). (J. M) WMEI Dkk1 w 24-godzinnych hodowlanych przodkach ujawniło zwiększone sygnały w warunkach niedoboru RA, w których nie udało się utworzyć płuca (K i M, gwiazdki). Poniżej, schematy przedstawiają morfologię każdego stanu po 72 godzinach. Ht, serce; Lu, płuco; St, żołądek; Th, tarczyca. Pasek skali: 450 .m (D. I); 300 | jm (J. M). Aby dowiedzieć się więcej na temat rozkładu transkryptów Dkk1 in vivo, przeprowadziliśmy analizę hybrydyzacji in situ (ISH) w zarodkach przed i na początku rozwoju płuc. Analiza embrionów E8.5. E9.5 WT ujawniła sygnały Dkk1 w ograniczonych miejscach w przednim przednim jelisku, takich jak łuki rozgałęzione (dane nie pokazane), ale nie w przyszłym polu płucnym (Figura 1B, 12 somitoprocesowym [12S] ]), zgodnie z wcześniejszymi raportami (12, 13). Przeciwnie, ekspresja Dkk1 była silna na całym przedramieniu Raldh2. /. mutanty na podobnym etapie (porównaj obszary w ramkach na Rysunku 1, B i C). Podwójna ISH (Dkk1) i immunohistochemia (Sox2, która oznacza endodermę przednią) wykazały, że w przypadku braku sygnalizacji RA, Dkk1 był eksprymowany ektopowo zarówno w warstwie mezodermalnej, jak i endodermalnej (Figura 1, B i C, dół). Aby dokładniej zbadać zależność między Dkk1 i RA, porównaliśmy wzorce ekspresji Dkk1 przez ISH całego zestawu (WMISH) i barwienie X-gal myszy reporterowej RA in vivo pod kontrolą RA (RARElacZ) i -deficient (Raldh2. /. RARElacZ) warunki. Co ciekawe, stwierdziliśmy, że całkowite Dkk1 i P-galaktozydaza ulegały ekspresji w odwrotnym układzie w zarodku E8.5. E9.5. Na przykład w zarodkach o wystarczającej odporności na RA, transkrypty Dkk1 były silne w regionach głowy i ogona, gdzie RARElacZ był nieaktywny (Figura 1, D, E, G i H). Odwrotnie, ekspresja Dkk1 była prawie nieobecna w pniu, włączając w to region midforegut, który wykazywał silne sygnały RARElacZ (Figury 1, D, E, G i H, regiony pudełkowe). Co godne uwagi, odkryliśmy powszechny wzrost ekspresji Dkk1 w zarodkach Raldh2 (3 (RARElacZ, linia z niedoborem RA niosąca kopię transgenu reporterowego RA, co potwierdziło brak aktywacji RA w większości struktur (fig. 1, F i I). . Następnie użyliśmy WMISH, aby określić, w jaki sposób ekspresja Dkk1 została zmieniona w eksplantatach narządów przednich, w których modulowaliśmy sygnalizację RA in vitro. Figura 1, J. M, przedstawia ekspresję Dkk1 w różnych warunkach doświadczalnych (góra, 24 godziny, dół, odpowiadające efekty morfologiczne po 72 godzinach, jak wcześniej podano, numery katalogowe 8, 9, 11). Sygnały Dkk1 były konsekwentnie silniejsze zarówno w endodermalnych, jak i mezodermalnych składnikach traktowanych BMS WT i Raldh2a /. przednie, niż w ich odpowiednich odpowiednikach RA
[podobne: depilacja laserowa twarzy, olej lniany na odchudzanie, kamikadze ]
[więcej w: przygotowanie do rektoskopii, centrum onkologii warszawa roentgena, kamikadze ]