Sieć zależna od kwasu retinowego w przednim obiegu kontroluje tworzenie mysiego płuca cd

Zwiększenie poziomu Dkk1 nie było ograniczone do przypuszczalnego pola płuc, ale było konsekwentnie widoczne w tym miejscu (Figura 1, J. M, obszary pudełkowe). Dane silnie sugerują, że ekspresja Dkk1 jest regulowana przez endogenny RA podczas organogenezy przedniego jelita i że ta regulacja może być funkcjonalnie odpowiednia dla pojawiającego się primordium płucnego. Dkk1 jest bezpośrednim celem RA w komórkach mezenchymalnych płuc. Aby uzyskać wgląd w mechanizm, dzięki któremu RA wpływa na ekspresję Dkk1, badaliśmy potencjalny bezpośredni wpływ RA w transkrypcji genu. Analiza sekwencji genomowych myszy Dkk1 ujawniła element reagujący na RA (RARE) 1,212 bp powyżej miejsca rozpoczęcia translacji. Fragment genomowy Dkk1 wklonowano do plazmidu zawierającego reporter lucyferazy zawierający y i transfekowano do komórek mezenchymalnych płuc (MLg). Komórki te pochodzą z mysich płuc noworodków; po aktywacji RA, pokazują funkcje. takie jak zwiększenie Tgf. cele i obniżenie Fgf10. które naśladują reakcje RA naszego systemu hodowli foregut (11, 14). Zgodnie z tym, analiza PCR w czasie rzeczywistym nietransfekowanych komórek MLg rosnących w pożywce kontrolnej wykazała niski poziom endogennego Dkk1; poziomy zostały dodatkowo zmniejszone przez leczenie RA (dodatkowa Figura 1A, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; doi: 10,1172 / JCI40253DS1). Traktowanie RA komórek MLg transfekowanych konstruktem-lucyferazą Dkk1-promotor znacząco zmniejszało aktywność lucyferazy w porównaniu z kontrolami. Spadek został zatarty przez mutację RZADKI w konstrukcie (dodatkowa Figura 1, B i C). Tak więc dane silnie sugerują, że RA bezpośrednio represjonuje transkrypcję Dkk1. RA reguluje sygnalizację Wnt podczas inicjacji morfogenezy płuc. Powyższe odkrycia skłoniły nas do zbadania, czy zmiany w ekspresji Dkk1 powodują zmiany w sygnalizacji Wnt w przednim jelicie. Aby ocenić kanoniczną aktywność Wnt w naszym systemie, wykorzystaliśmy myszy BATgal, dobrze scharakteryzowany model reportera LacZ oparty na elementach wiążących TCF (15). Poprzednie badania z użyciem BATgal lub TOPgal, innej kanonicznej linii reporterowej Wnt, wykazały aktywność reportera w endodermie związanej z wczesnym płucem (15. 17). Nie wykryliśmy aktywności BATgal w przednim jelicie przy E8.5, przed pojawieniem się pączków płuca (dane nie pokazane). Jednakże zidentyfikowano sygnały zarówno w nabłonkowych, jak i mezenchymalnych warstwach tchawicy i primordium płucnego (Figura 2, A i B). Aktywność BATgal była również obecna w pojawiających się pąkach płuca z kulturowych przodków w wyrostku RA (Figura 2C). Rycina 2RA regulacji Wnt podczas tworzenia się płuca. (A i B) E10.0 Płuca BATG (A, całe mocowanie, B, przekrój) pokazujące aktywność lacZ zarówno w nabłonku (Ep) i mezenchymie (Me; czerwona strzałka). (C. F) Kontrolny hodowlany przedni nos ujawnił aktywność BATg w regionach płuc i tarczycy (C), które zostały stłumione w polu płuc BG-BATgal (D) i Raldh2 A / B BATgal (E). Aktywność ta została zachowana w regionie tarczycy (powyżej żółtych linii) myszy Raldh2 (3 / BATgal (D i E), domeny znanej jako pozbawionej aktywności RA, jak widać u myszy reporterowych RARElacZ (F). Li, wątroba; Pa, trzustka. Oryginalne powiększenie, × 40 (B); × 20 (C, z prawej). (G) PCR w czasie rzeczywistym 24-godzinnych hodowlanych przodków, wykazujących znaczącą regulację w dół Axin2 i Lef1 w warunkach z niedoborem RA. * P <0,05. Następnie zbadaliśmy, w jaki sposób zakłócenie RA wpływa na sygnalizację Wnt. Aby pomóc monitorować aktywność kanoniczną Wnt, wygenerowaliśmy Raldh2. /. myszy niosące transgen BATgal (myszy Raldh2a / BATgal). Co ciekawe, nie wykryto sygnałów LacZ w domniemanym regionie płuc traktowanych BMS BATgal lub Raldh2 A / BATGG. Jednak sygnały były łatwo identyfikowane w bardziej przednich obszarach tych eksplantatów (ryc. 2, D i E, obszar powyżej żółtej linii). Sugerowało to selektywną regulację aktywności Wnt przez RA w środkowym jelcu (Figura 2F), zgodną z domeną aktywności RA wcześniej opisaną w przednim jelicie myszy RARElacZ. Ponadto, oceniliśmy ekspresję znanych celów Wnt, takich jak Axin2 i Lef1 (18, 19), w czasie rzeczywistym PCR i odkryliśmy znaczną obniżoną regulację tych genów w niedoborach RA z obu modeli (Figura 2G). Doszliśmy do wniosku, że kanoniczna Wnt jest regulowana przez sygnalizację RA podczas inicjacji morfogenezy płucnej. Tworzenie się pączków płucnych jest hamowane przez hamowanie Wnt. W jakim stopniu zakłócenie sygnalizacji Wnt przyczynia się do niepowodzenia w tworzeniu zawiązków płucnych w przedrakach z niedoborem RA. Rozumiemy, że interferowanie przede wszystkim z sygnalizacją Wnt w RA-wystarczających przodkach mogło odtworzyć fenotyp niedoboru RZS z niedoborem RA [hasła pokrewne: olej lniany na odchudzanie, centrum onkologii warszawa roentgena, laserowe wybielanie zębów cena ] [przypisy: rak płaskonabłonkowy płuca, podkolanówki kompresyjne, odchudzanie roku vita slim opinie ]