Sieć zależna od kwasu retinowego w przednim obiegu kontroluje tworzenie mysiego płuca czesc 4

Zastosowano dwa niezależne podejścia do zakłócenia sygnalizacji Wnt. Po pierwsze, przednie dziobki WT były leczone rekombinowanym mysim Dkk1, które wiąże się z receptorem Wnt Lrp5 / 6, co uniemożliwiało wiązanie się z Wnt (20). Alternatywnie, przedgry zostały poddane działaniu kwercetyny, flawonoidu, o którym wiadomo, że hamuje oddziaływanie pomiędzy Tcf i P-kateniną w jądrze (21). Prekursory płuc pochodzą z prymitywnego przedgrzybicy, jako grupa komórek endodermalnych tylnych do tarczycy, która eksprymuje homeoboks NK1 (Nkx2-1). Nkx2-1 jest najwcześniejszym znanym markerem losu komórek progenitorowych płuca, chociaż jest również wyrażany w tarczycy (22, 23). Figura 3, A i B przedstawiają typową hodowlę przedrzucawkową kontrolną z pojawiającymi się pąkami płucnymi wywierającymi ekspresję Nkx2-1. Rycina 3 Przerwanie tkanek prowadzi do agenezji pączka płuca we wstępnych zastojach RA. (A. F) Nkx2-1 WMISH (A, C i E) i odpowiadające H & E (B, D i F) kulturowanych przodków. Kontrolne przodki pokazały 2 wschodzące pąki płucne oznaczone przez Nkx2-1 (A i B). W potraktowanych Dkk1 przebarwieniach WT, Nkx2-1 nadal oznaczało pole płucne, ale nie było żadnych pąków (C i D), przypominających wyciągi WT traktowane BMS (E i F). (G. I) Barwienie X-gal wykazało silne sygnały RARElacZ zarówno w próchnicach kontrolnych jak i potraktowanych Dkk1 (G i H), w przeciwieństwie do braku sygnałów w przedrakach potraktowanych BMS (I). (J. L) Aktywność BATgA została zniesiona za pomocą traktowania Dkk1 (K) lub kwercetyną (Que; L) w porównaniu z kontrolą (J). Czerwone gwiazdki w literach C. F, H, I, K i L oznaczają przyszłe pole płuc. Oryginalne powiększenie, × 10 (A, C, E i G. L). Pasek skali: 250 .m (B, D i F). (M) Real-time PCR ujawnił regulację w dół Axin2 i Lef1 w 24-godzinnych hodowlanych przodkach poddanych działaniu Dkk1 lub kwercetyny. * P <0,05 względem kontroli. Leczenie inhibitorami Wnt miało zależny od dawki efekt negatywny w pączkowaniu płuc. Dkk1 nie miało wpływu na tworzenie pączków płucnych w przednich grotach przy 50 ng / ml. Przy 100. 200 ng / ml, Przodki potraktowane Dkk1 rozwinęły tylko pojedynczy pączek płuca (dane nie pokazane). Podobnie, kwercetyna nie miała wpływu na tworzenie się płuc w eksplantatach na przedramieniu przy 5 (im (dane nie przedstawione). Jednak przy wyższych dawkach 400 ng / ml Dkk1 (n = 15) i 10. M kwercetyny (n = 9) całkowicie stłumiły tworzenie się primordium płucnego, tak że potencjalne pole płuc było możliwe do zidentyfikowania jedynie przez miejscową endodermalną ekspresję Nkx2. -1. Zmniejszona intensywność sygnałów Nkx2-1 była zgodna z wymaganiem sygnalizacji Wnt, aby utrzymać endodermalny los komórek płuc w przednim jelicie (17, 24). Fenotyp Dkk1 był uderzająco podobny do fenotypu opisanego uprzednio w przedtrzonach potraktowanych BMS (n = 23, Figura 3, C = F, i odn. 8, 11). Tak więc, hamowanie Wnt w przedrakach WT prowadziło do agenezji płuc. Efekt ten nie był spowodowany zakłóceniem sygnalizacji RA lub ogólną toksycznością, ponieważ przednie wyściółki RARElacZ hodowane z rekombinowanym Dkk1 lub kwercetyną utrzymywały silne sygnały lacZ w przeciwieństwie do przedraków potraktowanych BMS (Figura 3, Gjl, i dane nie przedstawione). Zahamowanie aktywności Wnt przez leczenie Dkk1 lub kwercetyną potwierdzono przez utratę aktywności BATgal (Figura 3, J. L) i regulację w dół celów Wnt dla Axin2 i Lef1, jak oceniono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (Figura 3M). Wnt reguluje ekspresję Fgf10 podczas tworzenia płuc. Ekspansja komórek progenitorowych płuc i indukcja pączków jest krytycznie zależna od lokalnej aktywacji sygnalizacji Fgfr2b w endodermii przedniego jelita przez Fgf10 w sąsiadującej mezodermie (23, 25). Istnieją dowody na to, że kanoniczna Wnt bezpośrednio reguluje ekspresję Fgf10 w rozwijającym się sercu i kończynie (26, 27). Zapytaliśmy, czy mechanizm, za pomocą którego hamowanie Wnt wpływa na morfogenezę płuc, obejmuje również interakcje z Fgf10. Podczas organogenezy, Fgf10 był miejscowo eksprymowany w mezodermie związanej z pochodnymi foregut, takich jak płuca i tarczycy, zgodnie z wzorem obserwowanym w grupie kontrolnej (Figura 4A). Analiza eksplantów, w których leczenie Dkk1 prowadziło do agenezji pączków płucnych, nie ujawniła sygnałów Fgf10 w domniemanym polu płucnym (n = 5; Figura 4B), ponownie podobnym do defektów RA pozbawionych RA (n = 7, Figura 4C). Aby jeszcze bardziej skonsolidować związek między sygnalizacją Wnt a ekspresją Fgf10, przeprowadziliśmy eksperyment wzmocnienia funkcji przez potraktowanie przednich komórek przy użyciu powszechnie stosowanego inhibitora Gsk3b, SB216763. Związek ten hamuje zdolność Gsk3b do fosforylowania P-kateniny, umożliwiając w ten sposób translokację jądrową a-kateniny i transkrypcję kanonicznych celów Wnt (20). Hiperaktywację sygnalizacji Wnt wykazano przez powszechną ekspresję BATgal w tych przedżołądkach i przez regulację w górę Axin2 i Lef1 (porównaj Fig. 4, D i E, z Figurą 3J). Zgodnie z przewidywaniami, doprowadziło to do znacznego wzrostu sygnałów Fgf10 i rozszerzenia jego domen (Ryc. 4, porównaj A i F) [patrz też: ile kalorii ma mozzarella, niedobór witaminy d3 objawy u dorosłych, polana szymoszkowa basen ] [przypisy: balsam kapucyński ulotka, pompa insulinowa refundacja, depilacja laserowa twarzy ]