Staphylococcus aureus aktywuje sygnalizację IFN typu I u myszy i ludzi poprzez powtórzone sekwencje Xr białka A ad 7

Zrekombinowane białka fuzyjne z glutationem-S (GST) zawierające i 8 SSR wytworzono podobnie przez klonowanie regionu C-końcowego SpA z klinicznych izolatów (typ spa 515 i odpowiednio 131, Tabela dodatkowa 1) do pGEX-KG. W celu ekspresji rekombinowanego SpA lub SpA Xr, całonocne hodowle BL21 E. coli zawierające konstrukty p-GEX-KGa SpA zaszczepiono świeżą pożywką i hodowano do OD600 0,5. D-1-Tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) dodano do stężenia mM i kulturę hodowano przez kolejne 6 godzin. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 8000 g przez 10 minut w rotorze Sorvall GS-3. Osad ponownie zawieszono w PBS zawierającym inhibitory proteazy (Roche), lizozym (200 .g / ml) i DNazę I (3 .g / ml). Komórki poddawano lizie przez powtarzające się cykle zamrażania / rozmrażania. Szczątki komórek usunięto przez odwirowanie. Rekombinowane białka wyrażane z pGEX-KG zawierały N-końcową fuzję GST o 26 kDa. Białka fuzyjne GST oczyszczono przy użyciu modułu do oczyszczania MicroSpin GST (Amersham Biosciences, GE Healthcare) i dializowano wobec PBS. Linie komórkowe i kultury pierwotne. 1HAEo. i 16HBE, linie ludzkich komórek nabłonkowych dróg oddechowych (D. Gruenert, California Pacific Medical Center Research Institute, San Francisco, Kalifornia, USA), były hodowane jak wcześniej szczegółowo (40, 41). Pierwotne komórki nabłonkowe małych dróg oddechowych (SAEC, Lonza) hodowano w sposób spolaryzowany na półprzepuszczalnych nośnikach i stosowano pomiędzy pasmem 2 i 3. Myszowe komórki nabłonkowe dróg oddechowych, które mają bardzo niską aktywację endogenną STAT, były stosowane w całym badaniu, o ile nie wskazano. Komórki wyizolowano z przegrody nosowej ze wskazanych szczepów dorosłych myszy i hodowano w pierwotnej hodowli w sposób spolaryzowany, jak opisano wcześniej (42). trif. /. myszy były darem Iry Tabas na Uniwersytecie Columbia. Wpływ inhibitorów biochemicznych testowano przez wstępne poddawanie komórek działaniu 30 minut za pomocą dynasore (80 | jM, zsyntetyzowane przez H. Pelisha i dostarczone przez T. Kirchhausena, Harvard University, Boston, Massachusetts, USA), inhibitor 25. M JAK I ( Inhibitor Pan JAK, Calbiochem), inhibitor 50. M JAK2 (Calbiochem) i inhibitor 20. M STAT3 (Calbiochem). Podczas stymulacji uzupełniano inhibitory w pożywce. Aby zablokować wpływ zanieczyszczenia LPS, rekombinowane białka inkubowano z siarczanem polimyksyny B (50 .g / ml, Sigma-Aldrich) przez godzinę przed stymulacją. W celu wyczerpania IFN-y i IL-6, odpowiednie neutralizujące przeciwciała zastosowano w 2 x 104 U / ml (R & D Systems). Badania internacjonalizacji. W przypadku cytometrii przepływowej komórki inkubowano z skoniugowanym z Alexa Fluor 488a pełnej długości białkiem A (Molecular Probes, Invitrogen) lub Alexa Fluor 488. Skoniugowanymi SpA Xr (Protein Labelling Kit, Molecular Probes, Invitrogen) przez różne okresy czasu w 37 ° C. C lub 4 ° C. Komórki przemyto 3 razy i dodano trypsynę przez 30 minut w celu usunięcia związanego z powierzchnią białka A. Komórki przemyto, a pozostałą wewnątrzkomórkową fluorescencję zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej (FACSCalibur, BD). W przypadku mikroskopii konfokalnej komórki 16HBE hodowano na filtrach Transwell-Clear (Costar; Corning) z interfejsem powietrze-ciecz w celu utworzenia spolaryzowanych monowarstw. Komórki inkubowano ze skoniugowanym z białkiem Alexa Fluor 488P białkiem A (Molecular Probes, Invitrogen) i Alexa Fluor 546f skoniugowaną transferyną (Molecular Probes, Invitrogen) przez godzinę. Po przemyciu komórki utrwalono 4% paraformaldehydem, a filtry usunięto ze studzienek i zamontowano VECTASHIELD (Vector Laboratories) na szkiełkach. Test reporterowy P-laktamazy TEM-1. GST-SpA wklonowano do wektora pCX241, a powstałe białko fuzyjne GST-SpA. TEM-1 oczyszczono jak opisano powyżej i zastosowano do stymulacji komórek nabłonka dróg oddechowych. W różnych punktach czasowych (30 minut, 1, 2, 3 i 4 godziny) komórki były obciążone CCF2 / AM (Invitrogen), a odsetek niebieskich komórek fluorescencyjnych oznaczono za pomocą mikroskopu. Fluorescencję oznaczono również ilościowo za pomocą czytnika fluorescencji, jak opisano wcześniej (26). Real-time PCR. RNA wyizolowano przy użyciu zestawu QIAGEN RNeasy Mini i poddano obróbce DNazą zgodnie z instrukcjami producenta (QIAGEN). cDNA wytworzono z .g RNA przy użyciu zestawu iScript Synthesis Kit (Bio-Rad). W celu ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono amplifikację za pomocą Power SYBR Green Master Mix w termocyklerze Step One Plus (Applied Biosystems). Do amplifikacji użyto następujących primerów: mysiego IFN-a, 5a-AGACTATTGTTGTACGTCTCC-3. i 5-CAGTAATAGCTCTTCAAGTGG-3; mysz Mx-1, 5a-TGTGCAGGCACTATGAGGAG-3. i 5. -ACTCTGGTCCCCAATGACAG-3 .; mysz PKR, 5. -GCACCGGGTTTTGTATCGA-3. i 5a-GGAGCACGAAGTACAAGCGC-3 .; mysia IL-6, 5a-TGATGCACTTGCAGAAAACAA-3. i 5. -GGTCTTGGTCCTTAGCCACTC-3 .; mysz LIF, 5. -TCTTCCCATCACCCCTGTAAATG-3. i CTTGATCTGGTTCATGAGGTTGC-3 .; mysia aktyna, 5-CCTTTGAAAAGAAATTTGTCC-3. i 5A -agaAACCAGAACTGAAACTGG-3 .; ludzki IFN-y, 5a-CTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3. i 5. -CATCTCA
[podobne: osocze bogatopłytkowe opinie, kamikadze, laserowe wybielanie zębów cena ]
[hasła pokrewne: ile kalorii ma mozzarella, profilaktin koncentracja, paznokcie w kształcie migdałów ]