Staphylococcus aureus aktywuje sygnalizację IFN typu I u myszy i ludzi poprzez powtórzone sekwencje Xr białka A ad 8

Czterdzieści cykli prowadzono z denaturacją w temperaturze 95 ° C przez 15 sekund, hybrydyzacji w 55 ° C przez 30 sekund i wydłużaniem w 60 ° C przez 45 sekund. P-Atynę stosowano jako kontrolę standaryzacji. Wewnątrzkomórkowa ekspresja białka A. 1HAEo. komórki transfekowano przez nukleofekcję zgodnie z instrukcjami producenta (Amaxa) z wektorem pCMV-FLAG kodującym fuzje FLAG pełnej długości SpA, region N-końcowy SpA (zawierający 5 domen wiążących IgG) lub C-końcowy region SpA (SpA Xr). W przypadku mikroskopii konfokalnej, 48 godzin po transfekcji, komórki utrwalono 4% paraformaldehydem, permeabilizowano 0,3% Tritonem X-100 i barwiono na FLAG i fosfo-STAT3 (Ser727; Cell Signaling Technology). Western blot. Komórki poddano lizie z użyciem 60 mM n-oktylo-A-D-glukopiranozydu w TBS (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,8) zawierającego tabletki Complete Mini Protease Inhibitor (Roche), mM ortowanadanu sodu, 100 mM fluorku sodu i 20. M GM6001. Białka rozdzielano na 4%. 12% żelu Bis-Tris NuPAGE (Invitrogen), przenoszono na błonę PVDF Immobilon-P (Millipore) i blokowano 5% mlekiem w TBST (sól fizjologiczna buforowana Tris plus Tween) (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Immunodetekcja została przeprowadzona przy użyciu p-STAT1 (Y701, Cell Signaling Technology), p-STAT2 (Y689, Millipore), p-STAT3 (Y705, Cell Signaling Technology), STAT1 (Cell Signaling Technology), STAT2 (królicze poliklonalne uzyskane z C. Schindlera na Uniwersytecie Columbia), STAT3 (Cell Signaling Technology) i przeciwciała P-aktyny (Sigma-Aldrich), a następnie przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z peroksydazą chrzanową (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Wykrywanie IL-6. 1HAEo. komórki, odsączone od surowicy przez 24 godziny, lub komórki nabłonkowe pierwotnych dróg oddechowych myszy eksponowano na wskazany bodziec, a IL-6 w supernatancie mierzono za pomocą testu ELISA. Pary przeciwciał IL-6 (Pierce Endogen, Thermo Scientific) zastosowano do wykrywania ludzkich IL-6 (komórki 1HAE0a), a IL-6 DuoSet (R & D Systems) zastosowano do wykrywania mysiej IL-6. Badania na myszach. Myszy C57BL / 6 (w wieku od 7 do 10 dni) inokulowano donosowo 10 .l S. aureus (108 CFU), białko Aulus S. aureus (108 CFU) (43), C-końcowy region SpA (SpA Xr, 50 .M) lub PBS (kontrola). 6-nadziesięcioletni Ifnar. /. lub myszy 129 / SvEV znieczulono 100 mg / kg ketaminy i 5 mg / kg ksylazyny i donosowo zaszczepiono 107 lub 108 CFU S. aureus szczep USA300. Myszy uśmiercono w 24 godziny po zakażeniu bakteryjnym przez przedawkowanie pentobarbitalu. Płyny BAL uzyskano przez wkroplenie 3 x ml HBSS do tchawicy eutanazowanych zwierząt i wirowanie przy 180 g przez 10 minut. W celu identyfikacji komórek odpornościowych, zawiesiny komórkowe uzyskano z homogenatów płuc lub płynu BAL, a czerwone komórki zostały poddane lizie. Pozostałe komórki zawieszono w PBS zawierającym 10% normalnej surowicy myszy i inkubowano przez 30 minut w 37 ° C. Komórki następnie barwiono kombinacjami znakowanego PE anty-CD45, znakowanego FITC anty-Ly6G (BD Biosciences. Pharmingen), znakowanego PE-Cy5,5. Anty-CD11b (eBioscience) i znakowanego APC anty-CD11c (eBioscience ) w obecności mysiego bloku Fc (2,4G2; BD Biosciences. Pharmingen) i normalnej surowicy mysiej. Próbki z negatywną kontrolą inkubowano z nieistotnymi przeciwciałami dobranymi izotypowo. Komórki bramkowano w oparciu o ich profil rozproszenia do przodu / rozproszenia bocznego i analizowano pod kątem podwójnej ekspresji CD45 i Ly6G dla PMN. DC zidentyfikowano przez dwukrotne barwienie dla CD11c i CD11b w populacji CD45 +. Dla IFN-y i ocenę ilościową mRNA dla IL-6, płuca myszy uzyskano w 16. 18 godzin po inokulacji i przechowywano w RNAlater (QIAGEN). Liczbę bakterii w płucach i śledzionach określono przez wysianie kolejnych serii na płytkach z agarem CYGP. IL-6 i TNF-a w płynie BAL wykryto metodą sandwich ELISA (odpowiednio R & D Systems i eBioscience). Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytut Medycyny Porównawczej na Uniwersytecie Columbia. Barwienie immunofluorescencyjne mysich sekcji płuc. Płuca myszy napompowano i utrwalono przez noc w 4% paraformaldehydzie przed zatopieniem w parafinie. Sekcje seryjne po 5 .M odparowano w ksylenach, ponownie uwodniono, poddano odzyskiwaniu antygenu, permeabilizowano w 0,3% Triton X-100 i zablokowano w 5% normalnej surowicy koziej przed barwieniem przeciwciałami przeciwko p-STAT3 (S727) lub całkowitym STAT3. Pierwotne przeciwciała zostały ujawnione przez skoniugowane wtórne przeciwciała Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Obrazowanie przeprowadzono na konfokalnym mikroskopie skaningowym Zeiss LSM 510 META i analizowano za pomocą oprogramowania LSM Image Browser (wersja 4.2). Statystyka Próbki o normalnym rozkładzie analizowano za pomocą testu dwustronnego ucznia. Próbki, które nie były zgodne z normalnymi rozkładami, analizowano za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya. Badania śmiertelności zostały poddane dokładnemu testowi Fishera. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Materiały uzupełniające Zobacz Uzupełnienia danych Podziękowania Niniejsza praca została wsparta przez grant NIH 1R01HL079395-01A2 dla A. Prince. Autorzy chcieliby wyrazić swoją wdzięczność Carolyn Lee i Courtney Plumlee na Uniwersytecie Columbia za ich pomoc w tych badaniach. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Zastosowano niestandardowe skróty: BAL, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe; GST, transferaza S-glutationowa; IFNAR, IFN -. /. receptor 1; PMN, leukocyt z polimorfonukleinami; SpA, białko A gronkowców; SSR, region powtórzenia sekwencji krótkiej sekwencji; TNFR1, receptor czynnika martwicy nowotworu; TRIF, interferon indukujący adapter, zawierający domenę TIR; Tyk2, kinaza tyrozynowa 2. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.119: 1931. 1939 (2009). doi: 10.1172 / JCI35879 Obecny adres Marisy I. Gomez to: Wydział Mikrobiologii, Uniwersytet Buenos Aires, Buenos Aires, Argentyna.
[patrz też: niedobór witaminy d3 objawy u dorosłych, witamina c lewoskrętna wikipedia, depilacja laserowa twarzy ]
[więcej w: ból piszczeli po bieganiu, witamina c lewoskrętna wikipedia, osocze bogatopłytkowe opinie ]