Staphylococcus aureus aktywuje sygnalizację IFN typu I u myszy i ludzi poprzez powtórzone sekwencje Xr białka A cd

Używając 10-krotnie niższego subletalnego inokulum, byliśmy w stanie porównać odpowiedzi immunologiczne na USA300 u myszy. Nie było różnic w poziomach zakażenia (Figura 2B) ani w liczbie leukocytów polimorfojądrowych (PMN) rekrutowanych do płuc Ifnar. /. i myszy WT w 4 lub 24 godziny po inokulacji (Figura 2C). Chociaż było nieco więcej bakteriemii w 4 godzinie w Ifnar. /. zwierząt (ryc. 2B), była to mniejsza niż logarytmiczna różnica, która zniknęła po 24 godzinach. Rycina 2 Sygnalizacja IFN typu I zwiększa podatność na infekcje dróg oddechowych gronkowców. Adult WT or Ifnar. /. myszy zakażono donosowo (A) 5 x 108 CFU S. aureus USA300 i śmiertelność oznaczono po 24 godzinach. * P = 0,0055, dokładny test Fishera; n = 10 myszy na grupę. Myszy zakażono 5 x 107 CFU S. aureus USA300 i w 4 i 24 godziny po zakażeniu (B), określono obciążenia bakteryjne w płucach i śledzionach i zawiesinach płuc oraz komórki otrzymane przez wybarwienie płynu BAL i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu wyliczenia (C) CD45 + Grl + PMN i (D) CD11c + CD11b + CD45 + DC. Dane są reprezentowane jako procent całkowitej populacji CD45. (E) TNF-a i IL-6 wykryto w płynie BAL i we krwi za pomocą testu ELISA. Każdy punkt reprezentuje zwierzę; linie poziome reprezentują wartości mediany. The Ifnar. /. myszy miały znacznie więcej CD11c + DC zarówno w homogenatach płuc, jak i płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), które utrzymywały się przez 4 do 24 godzin (Figura 2D). W tym samym czasie punkty, Ifnar. /. myszy miały znacząco mniej TNF-a i trend w kierunku mniejszej IL-6 w płynie BAL w porównaniu ze zwierzętami WT (Figura 2E). Ogólnoustrojowe poziomy TNF-a były minimalne w obu grupach i przynajmniej o rząd wielkości mniejsze niż wykrywane w płynie BAL (ryc. 2E). Te odkrycia sugerują, że główny wpływ sygnalizacji IFN typu I w odpowiedzi na S. aureus występuje w płucach i obejmuje populację DC i regulację odporności. Domena Xr SpA aktywuje IFN-y sygnalizacja. SpA została już wykazana jako krytyczna w patogenezie zapalenia płuc w mysim modelu zakażenia (7). Następnie przeanalizowaliśmy wkład każdej z subdomen SpA w aktywację odpowiedzi IFN typu I w komórkach nabłonka dróg oddechowych. Domeny SpA subklonowano w celu określenia, czy domena Xr jest zarówno konieczna, jak i wystarczająca do aktywacji odpowiedzi IFN typu I: mianowicie endocytoza ligandu, IFN-a. transkrypcja i aktywacja JAK-STAT (Figura 3). Figura 3SpA jest internalizowana i indukuje sygnalizację IFN typu w komórkach nabłonka dróg oddechowych. (A-E) Komórki dróg oddechowych inkubowano z SpA lub SpA Xr i internalizację (A) monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej (MFI, zmiana średniej intensywności fluorescencji) lub (B) za pomocą mikroskopii konfokalnej dla SpA (zielony) i transferyny (czerwony). po godzinie (oryginalne powiększenie, × 80). (C) IFN-y indukowany SpA wytwarzanie mierzono po 2 godzinach metodą PCR w czasie rzeczywistym w obecności Dynasore (Dyn), (D) w odpowiedzi na transfekcję plazmidu SpA Xr (Xr) lub pustego wektora (CV) i (E) w obecności 50 .g / ml polimyksyny B. (F) Fosforylację STAT1 i STAT3 w odpowiedzi na SpA (S) lub LPS (L) po i 2 godzinach monitorowano w mysich komórkach nabłonka nosa z WT lub trifluorometanosulfonianu. myszy. (G) Monitorowano fosforylację STAT1 i STAT3 w komórkach dróg oddechowych w odpowiedzi na SpA Xr (30 min., N = 2; 60 i 120 min., N = 3), w obecności Dyn (n = 3), Inhibitor JAK (Pan, n = 3), inhibitor JAK2 (JAK2, n = 3) lub neutralizujące przeciwciało przeciwko IFN-y (n = 2). Cienkie pionowe linie między pasmami wskazują dane splatane razem z oryginalnego blotu. Czerwone strzałki wskazują, że te same pasma od 120 min. Traktowanie Xr zastosowano jako kontrolę w przypadku leczenia inhibitorami pan-JAK i JAK2. U, M lub Unstim. wskazuje niestymulowaną kontrolę. O ile nie wskazano inaczej, dane pokazują średnie wartości potrójnych próbek z reprezentatywnego eksperymentu na 3, a słupki błędu wskazują odchylenia standardowe. * P <0,001; ** P <0,05. W celu określenia, czy SpA jest endocytozowane, inkubowaliśmy znakowany fluorescencyjnie SpA o pełnej długości lub konstrukt składający się z domeny Xr ze szczepu Newmana (który jest praktycznie identyczny ze SpA of USA300) z ludzkimi komórkami nabłonka dróg oddechowych w hodowli pierwotnej i liniach komórkowych; po wielokrotnym płukaniu i traktowaniu trypsyną w celu usunięcia związanego z powierzchnią SpA, testowaliśmy pod kątem wewnątrzkomórkowego SpA (Figura 3A). Znaczną internalizację wykrywano przez godzinę inkubacji i znacznie hamowano w komórkach utrzymywanych w temperaturze 4 ° C lub traktowano inhibitorem dynaminowym inhibitorem (26), co sugeruje proces endocytowy. Obrazowanie konfokalne było zgodne z akumulacją SpA w endosomach, ponieważ w dużym stopniu kolokalizowało się z transferyną (Figura 3B) [przypisy: witamina c lewoskrętna wikipedia, olej lniany na odchudzanie, niedobór witaminy d3 objawy u dorosłych ] [przypisy: centrum onkologii warszawa roentgena, kamikadze, rak płaskonabłonkowy płuca ]