Staphylococcus aureus aktywuje sygnalizację IFN typu I u myszy i ludzi poprzez powtórzone sekwencje Xr białka A czesc 4

Translokację zinternalizowanego SpA do cytosolu oceniano przez inkubację komórek nabłonka dróg oddechowych z białkiem fuzyjnym SpAa-laktamazy i oznaczanie aktywności .-laktamazy cytosolowej przy użyciu wcześniej opisanego układu reporterowego (27). SpA nie ulegał translokacji z pęcherzyków do cytosolu w badanym okresie czasu (30 minut do 4 godzin) (dane nie przedstawione). Inkubacja komórek dróg oddechowych za pomocą SpA Xr przez 2 godziny indukowane IFN-a transkrypcja; ta indukcja IFN-y transkrypcja w odpowiedzi na SpA Xr była znacząco zablokowana hamowaniem dynaminy (Figura 3C). Ponieważ te konstrukty zsyntetyzowano w postaci nadekspresjonowanych białek w Escherichia coli, przeprowadzono kilka eksperymentów kontrolnych, aby wykluczyć możliwość, że zanieczyszczające LPS wpłynęło na nasze doświadczenia. Jako jedną z kontroli, transfekowaliśmy komórki dróg oddechowych plazmidem eksprymującym SpA Xr lub kontrolą wektorową i udokumentowaliśmy 10-krotny wzrost IFN-y. wytwarzanie mRNA w porównaniu z wywołanym przez pusty wektor (Figura 3D). Ponadto, rekombinowane białko Xr poddano wstępnej obróbce polimyksyną B, która blokowała IFN-y indukowany przez LPS. i wytwarzanie Mx-1, ale nie stymulowane przez SpA Xr (Figura 3E). Pokazano, że białko adaptorowe TRIF ma zasadnicze znaczenie w łączeniu receptorów rozpoznających wzorce z IFN-y. sygnalizacja. Przewidywaliśmy, że aktywacja szlaku za pośrednictwem SpA będzie w podobny sposób zależna od TRIF. Fosforylacja STAT1 w odpowiedzi na LPS lub SpA nie była obserwowana w komórkach nabłonka z trifluorometanosulfonianu /. myszy w porównaniu z tymi z kontroli WT (Figura 3F). Fosforylacja STAT3 była tylko częściowo zredukowana u tych zwierząt, co wskazuje, że istnieją szlaki inne niż TRIF i nie-IFN-a, które wywołują aktywację STAT3. Wydaje się, że główne składniki IFN-y ścieżka jest aktywowana zarówno przez LPS, jak i SpA, chociaż specyficzny receptor (receptory) i białka pomocnicze pozostają do zidentyfikowania. Po IFN-y produkcji, IFNAR był stymulowany przez autokrynną ścieżkę, aktywując sygnalizację JAK-STAT, aby zainicjować ekspresję genu, którą monitorowaliśmy jako fosforylację STAT przez komórki nabłonka (28). Ludzkie komórki nabłonkowe dróg oddechowych inkubowane z domeną SpA Xr wykazywały zależną od Dynami fosforylację tyrozyny STAT1 i STAT3, w której pośredniczy aktywacja JAK1 lub Tyk2, ale nie JAK2 (Figura 3G), chociaż znaczne ilości konstytutywnego fosfo-STAT3 były obecne w niestymulowanych komórkach. Anty-IFN-y hamowały fosforylację STAT1, ale nie STAT3 (zgodnie z sygnalizacją przez receptory gp130, które wykorzystują STAT3). Fosforylację STAT3 (Ser727) wykryto w komórkach transfekowanych wektorem kodującym pełnej długości SpA lub domenę Xr, ale nie w komórkach dróg oddechowych wyrażających koniec SpA N, co wskazuje na specyficzność względem domeny Xr (dodatkowa Figura 2A). Produkcja IL-6 jest głównym produktem sygnalizacji JAK-STAT, a nabłonkowe wytwarzanie IL-6 w znacznym stopniu przyczynia się do patofizjologii związanej z zakażeniem gronkowcem. Komórki w pierwotnej hodowli wytwarzały mRNA i białko IL-6 w odpowiedzi na domenę Xr SpA w sposób zależny od dynaminy, która była zablokowana przez ekspozycję na anty-IFN-y. (Figura 4A). Komórki transfekowane SpA Xr również wytwarzały IL-6 (dodatkowa postać 2B). Zaangażowanie sygnalizacji JAK-STAT w wytwarzanie IL-6 zostało udokumentowane przez monitorowanie odpowiedzi w komórkach pierwotnych dróg oddechowych od Stat1. /. myszy lub pierwotne komórki myszy WT traktowane inhibitorem STAT3 (Figura 4B). Stat1. /. komórki i te leczone inhibitorem STAT3 nie wytwarzały mRNA IL-6 w odpowiedzi na ekspozycję na Xr (Figura 4B). Fosforylacja STAT3 była nienaruszona w komórkach ze Stat1. /. zwierzęta w odpowiedzi na SpA Xr, ale zasadniczo zmniejszone u zwierząt traktowanych inhibitorem STAT3 (Figura 4B). Te eksperymenty wskazują, że zarówno STAT1, jak i STAT3 są fosforylowane w odpowiedzi na SpA Xr i oba przyczyniają się do wytwarzania IL-6. Figura 4SpA Xr indukuje IFN-y oraz wytwarzanie IL-6 zależne od STAT3. (A) Komórki nabłonkowe dróg oddechowych w hodowli pierwotnej stymulowano SpA Xr przez wskazany czas lub przez 2 godziny pod nieobecność lub obecność dynasore, a indukcję IL-6 wykrywano metodą PCR w czasie rzeczywistym (czarne słupki, lewa oś y) lub ELISA (białe słupki, prawa oś y). Nieleczone komórki lub komórki stymulowane SpA Xr inkubowano z przeciwciałem neutralizującym IFN-y, a indukcję IL-6 mierzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Wytwarzanie mRNA dla IL-6 wyrażono jako indukcję fałdu w porównaniu z indukcją niestymulowanych komórek. (B) Komórki nabłonkowe dróg oddechowych z WT lub Stat1. /. myszy stymulowano SpA Xr pod nieobecność (kontrola) lub obecność wskazanych inhibitorów, a wytwarzanie IL-6 mierzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym
[hasła pokrewne: polana szymoszkowa basen, laserowe wybielanie zębów cena, centrum onkologii warszawa roentgena ]
[przypisy: podkolanówki kompresyjne, odchudzanie roku vita slim opinie, balsam kapucyński ulotka ]