Supresor sygnalizacji a1 (SOCS1) cytokiny jest nowym celem terapeutycznym dla indukowanego przez enterowirusa uszkodzenia serca ad

Stosowany w tym badaniu wirus Coxsackie B3 (CVB3) pochodził z infekcyjnej kopii cDNA kardiotropowego szczepu H3 (wariant Woodruffa) CVB3 (24). Miana wirusa oznaczano na monowarstwach komórek HeLa przy użyciu standardowego testu tworzenia łysinek, a izolację wirusa z serca i wątroby przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (25). Rekombinowane wektory adenowirusowe zawierające geny dla LacZ, znakowanego Myc SOCS1, znakowanego Myc SOCS3 i rekombinazy Cre zostały przygotowane na komórkach 293, jak opisano wcześniej (26). Rekombinowane adenowirusy wyrażające dnSOCS1 sterowane przez promotor CMV wytworzono jak opisano wcześniej (27). Aby wygenerować wektory zawierające adenowirusy (AAV) zawierające dnSOCS1, cDNA znakowanego Myc dnSOCS1 subklonowano do plazmidu AAV, pSub201 (28), pod kontrolą miejsca wczesnego wczesnego promotora CMV pomiędzy odwróconymi powtórzeniami AAV. Rekombinowany wirus AAV-dnSOCS1 wytworzono przez protokół potrójnej transfekcji i oczyszczono jak opisano wcześniej (29). Przeciwciała. Barwienie metodą Western blot i immunofluorescencję przeprowadzono jak opisano wcześniej (4,18) z użyciem przeciwciał anty-STAT1, anty-fosfo-STAT1, anty-STAT3 i anty-fosfo-STAT3 (New England BioLabs Inc., Beverly, Massachusetts , USA); królicze poliklonalne przeciwciało anty-CVB3 (dar A. Henke, Instytut Wirusologii, Uniwersytet Friedricha Schillera, Jena, Niemcy) (30); przeciwciało anty-c-Myc (A-14) (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA); i przeciwciałem anty-galaktozydazy (Cortex Biochem Inc., San Leandro, Kalifornia, USA). Generowanie transgenicznych myszy SOCS1. Wektor pGL-a MHC-SOCS1 skonstruowano przez subklonowanie cDNA SOCS1 znakowanego Myc (18) do miejsca klonowania Hindlll plazmidu pGL-a MHC (hojnie dostarczonego przez T. Kubota i J. Robbins). Po trawieniu BamHI, fragment niosący promotor. MHC i cDNA SOCS1 zastosowano do mikroiniekcji do zygot (C57BL / 6 X C3H) F1 (B6C3-F1). Jajka, które przeżyły mikroiniekcję, zostały przeniesione do jajowodów biorcy rzekomych samic pseudopregnujących. Myszy transgeniczne zidentyfikowano przez analizę PCR genomowego DNA ogona, a ekspresję białka potwierdzono przez immunoblotting z przeciwciałem anty-Myc (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Ustalono cztery niezależne linie transgenicznych myszy. W celu przeprowadzenia eksperymentów na linii wsobnej transgenicznych myszy SOCS1, które są podatne na infekcję wirusową, przez pięć pokoleń krzyżowaliśmy wstecznie trzy transgeniczne linie z myszami Balb / c. Echokardiogram. Avertin (2,5%) podawano dootrzewnowo w ilości 0,015 ml / g masy ciała. Dodatkowe dawki znieczulenia podawano po początkowej dawce w razie potrzeby w celu utrzymania odpowiedniego poziomu znieczulenia. Nagrywanie przeprowadzono jak opisano wcześniej (31). Skurczowe wymiary końcowoskurczowe i końcowo-rozkurczowe lewej komory (odpowiednio LVESD i LVEDD) mierzono w śledzeniu w trybie LV M-mode. Procentowy skrócenie frakcji (% FS) LV obliczono jako% FS = (LVEDD