Ukierunkowana delecja CX3CR1 ujawnia rolę fraktalkiny w odrzucaniu aloprzeszczepu serca cd

W odstępach od 3 do 21 dni po pierwszej dawce NTS uśmiercano grupy myszy (3 <4 / grupę), nerki zbierano, a krew pobierano przez nakłucie serca. Immunopatologia nerkowa. Połówki nerki utrwalono przez noc w 4 ° C w 10% obojętnej buforowanej formalinie, zatopiono w parafinie, podzielono na 4 .m i wybarwiono odczynnikiem Schiffa okresowym kwasem i trichromem Massona dla rutynowej histologii. Wszystkie oceny morfologiczne przeprowadzono w sposób zaślepiony z trzema lub czterema nerkami z każdej grupy w każdym punkcie czasowym, jak opisano (17). Patologię kłębuszkową oceniano, oceniając co najmniej 100 kłębuszków nerkowych na nerkę pod względem hiperkomórkowości, martwicy, hyalinozy, mikroanocząsteczek i tworzenia się sierpów. Uszkodzenie śródmiąższowe oceniano przez określenie proporcji kanalików korowych z atrofią, martwicą, rozszerzeniem lub odlewami oraz proporcją nacieków zapalnych zawierających korę-śródmiąższ. Snap-frozen połówki nerki również podzielono i zbadano za pomocą mAbs dla markerów powierzchniowych leukocytów myszy, jak opisano (17). Czynność nerek. Wydalanie białka w moczu mierzono w odstępach od 0 do 21 dni na nocnych zbiorach moczu od myszy przebywających w pojedynczych klatkach metabolicznych. Podczas pobierania moczu myszy miały swobodny dostęp do wody, ale nie do jedzenia. Stężenie białka oznaczano za pomocą zestawu odczynników do oznaczania PR mikroproteiny (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Azot mocznika we krwi mierzono na próbkach surowicy pobranych w odstępach od 0 do 21 dni przy użyciu zestawu do oznaczania azotu mocznikowego (Sigma Chemical Co.). Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia. CX3CR1 + / + i CX3CR1. /. myszy (n = 10 / grupę) immunizowano podskórnie 100 .g peptydu MOG (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) w CFA (Sigma Chemical Co.) z dodatkiem antygenu Mycobacterium tuberculosis (4 mg / ml) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) ; myszy otrzymywały również 150 ng toksyny krztuśca (Sigma Chemical Co.) przez dożylne wstrzyknięcie w dniu 0 i dniu 2, jak opisano (18). Myszy ważono i oceniano codziennie w sposób zaślepiony, jak opisano (18). Wyniki były następujące: 0, normalne; 1, utrata tonu ogona; 2, niedowład tylny; 3, paraliż tylny i utrata odpowiedzi prostującej; i 4, tetrapareza / konwój. Porównania częstości i nasilenia choroby przeprowadzono, odpowiednio, za pomocą testu dokładnego Fishera i testu dwustronnego t. Przeszczep. Heterotopowe przeszczepy serca przeprowadzono jak opisano (19), stosując donory BALB / c (H-2d) iw pełni niezgodne z MHC CX3CR1 (3 /. lub odbiorniki CX3CR1 + / + B6 / 129 (H-2b) (n = 6 / grupa); kontrolne myszy B6 / 129, w tym myszy z miotu i myszy CX3CR1 + / + uzyskane z The Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA). Cyklosporynę A (CsA) (Sigma Chemical Co.) rozpuszczono w oliwie z oliwek i podawano codziennie (10 mg / kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe) przez 14 dni, poczynając od dnia wszczepienia. Immunopatologia serca. Ocenę histologiczną przeprowadzono na skrawkach parafinowych barwionych hematoksyliną i eozyną (H & E). Komórki infiltrujące wykrywano przez barwienie immunoperoksydazą sekcji kriostatu ze szczurzym mAb przeciwko mysim myszom (PharMingen) i królicze anty-szczurze przeciwciała poliklonalne Ab Fk i CX3CR1 (Torrey Pines Biolabs, Houston, Texas, USA), jak opisano (20). Skrawki immunologiczne wybarwione alloprzeszczepami w kilku odstępach czasu po transplantacji (dni 1, 3 i 7), plus próbki z przedtrzonowca (dzień 0), oceniano za pomocą morfometrii ilościowej, stosując 20 pól na szczep i 3 przeszczepy na grupę (21). Testy ochrony rybonukleazami. Ekspresję wewnątrzcząstkową mRNA z cytokiną, chemokiną i receptorem chemokin oznaczano za pomocą testu ochrony rybonukleazowej (RPA) w 7 dniu po przeszczepie (n = 3 / grupa), stosując zestawy RiboQuant z PharMingen. Poziomy ekspresji znormalizowano względem ekspresji genów GAPDH lub L32 (21, 22). Analizę RPA przeprowadzono dwukrotnie za każdym razem przy użyciu oddzielnych zestawów przeszczepów. W przypadku Fk, klon znacznika sekwencji wyrażonej mysią (nr dostępu GenBank AA273590) potwierdzono przez sekwencjonowanie i subklonowano w celu przygotowania matrycy RPA, co dało w rezultacie fragment chroniony 256 pz po trawieniu nukleazą. Wyniki Generowanie CX3CR1. /. myszy. Aby selektywnie usunąć CX3CR1, wygenerowaliśmy wektor docelowy, w którym cały region kodujący został zastąpiony genem oporności na neomycynę (Figura 1). Klony komórek ES badano przesiewowo pod kątem prawidłowej rekombinacji homologicznej i wstrzykiwano do blastocyst w celu wytworzenia chimerycznych samców myszy. Krycia pomiędzy heterozygotycznym potomstwem tych myszy prowadziły do myszy homozygotycznych pod względem delecji CX3CR1 (Figura 2). CX3CR1. /. myszy urodziły się przy oczekiwanych proporcjach Mendla: 19 CX3CR1 + / + (23%); 43 CX3CR1 + /. (51%); i 22 CX3CR1. /. (26%)
[więcej w: ból piszczeli po bieganiu, pompa insulinowa refundacja, olej lniany na odchudzanie ]
[patrz też: pompa insulinowa refundacja, depilacja laserowa twarzy, badania kontrolne po urlopie macierzyńskim ]