Ukierunkowana delecja CX3CR1 ujawnia rolę fraktalkiny w odrzucaniu aloprzeszczepu serca czesc 4

Nie wykazywały jawnych nieprawidłowości rozwojowych lub morfologicznych i były płodne. Kierowana delecja genu CX3CR1. Genomowy DNA potomka heterozygotycznych (+ / p) rodziców F2 przeszukiwano za pomocą zarówno analizy Southern blot, jak i PCR. (a) Southern blot. Tłumienie restrykcyjne endonukleazą Hindlll zostało sondowane fragmentem z 5. nieulegający translacji region i wytworzył dzikiego typu fragment o wielkości 8 kb i docelowy fragment o wielkości 3,1 kb. Dzikich i ukierunkowanych fragmentów wskazuje genotyp każdej myszy pokazanej powyżej linii. (b) PCR. Zastosowano zestaw trzech starterów: jeden 5. podkład, który wyżarzał w 5. nieprzetłumaczony region i dwa 3. primery, po jednym z genów neo i CX3CR1. W wyniku reakcji uzyskano prążki o wielkości 700 pz dla allelu typu dzikiego i 500 pz dla docelowego allelu. Adhezja leukocytów krwi obwodowej do Fk. CX3CR1 jest jedynym niewirusowym receptorem znanym z interakcji z Fk (2, 23). Aby ustalić, czy delecja CX3CR1 wyeliminowała wszelką aktywność w kierunku Fk, zmierzono adhezję mysich leukocytów krwi obwodowej do przyczepionego Fk w teście statycznej adhezji. Leukocyty z myszy CX3CR1 + / + przylegały dobrze do Fk, a dodatek rozpuszczalnego Fk zmniejszał tę interakcję do poziomów zbliżonych do tła (Figura 3). Przeciwnie, nie byliśmy w stanie wykryć swoistego wiązania komórek z CX3CR1 | /. do Fk, co sugeruje, że brakowało funkcjonalnych receptorów Fk. Figura 3 Adhezja komórek krwi obwodowej do Fk. Krew obwodową uzyskano z myszy CX3CR1 typu dzikiego i zerowych, a leukocyty izolowano jako kożuszek leukocytarny. Komórki znakowano barwnikiem fluorescencyjnym 2a, 7a-bis- (2-karboksyetylo) -5- (i-6) -karboksyfluoresceiną, estrem acetoksymetylowym i badano pod kątem adhezji do Fk w komorach hodowli komórkowej. Nadmiar komórek wymyto po 30-minutowej inkubacji i mierzono adhezję w funkcji fluorescencji. Wyniki są zgłaszane jako arbitralne jednostki fluorescencyjne. Nadmiar rozpuszczalnego Fk (100 nM) dodano, aby konkurować z adhezją do zakotwiczonego Fk. Ten test jest reprezentatywny dla trzech wykonanych. Adhezja komórek typu dzikiego została znacznie zmniejszona przez dodanie rozpuszczalnego Fk (P <0,001). Ekspresję CX3CR1 wykazano na krążących monocytach i limfocytach T u ludzi i szczurów oraz na komórkach NK u ludzi i myszy (2, 10, 23, 24). Użyliśmy testu adhezji Fk do identyfikacji typów komórek w mysiej krwi obwodowej, która oddziałuje z Fk. Jak pokazano na rysunku 4a, chociaż komórki T CD3 + stanowiły duży procent komórek wejściowych, praktycznie żaden nie przylegał do Fk w teście statycznym. Większość komórek, które wiążą się z Fk, wybarwiło obecność CD11b, markera dla monocytów i neutrofili. MAb GR1 specyficzne względem neutrofili nie barwiło populację adherentnych komórek, co wskazuje, że te komórki były w przeważającej mierze monocytami. Ponadto, oczyszczone mysie neutrofile nie przyległy do Fk (dane nie pokazane). Dane te są kwantyfikowane na rysunku 4b. Ponieważ komórki NK zawierają niewielką część całkowitych leukocytów krwi obwodowej, zostały one oczyszczone i przeanalizowane osobno. Jak pokazano na Figurze 4c, oczyszczone komórki NK, ale nie komórki T CD3, wykazywały specyficzne wiązanie z unieruchomionym Fk. Wyniki te wskazują, że mysie monocyty i komórki NK, ale nie komórki T, wyrażają funkcjonalne receptory Fk i że CX3CR1 odgrywa niepotrzebną rolę w adhezji komórkowej do Fk. Rysunek 4 Typy komórek przylegające do Fk. (a) Leukocyty krwi obwodowej z myszy CX3CR1 + / + izolowano jako kożuszek leukocytarny i wirowano na szkiełku (cytospina) lub pozostawiano do przylgnięcia do Abte Fuck (przylegające Fk). Komórki następnie znakowano biotynylowanymi Ab (na CD3 lub CDllb) i streptawidyną fluorescencyjną w celu identyfikacji. Zapisano obrazy jasnego pola i fluorescencyjne. (b) Ocena ilościowa typów komórek wiążących się z Fk. Zliczono trzy pola dla każdego warunku znakowania, i pokazano odsetek każdego rodzaju komórek w populacji wejściowej i populacji przylegającej do Fk. Pokazany eksperyment jest reprezentatywny dla dwóch. (c) Adhezja oczyszczonych komórek NK i T do Fk. Komórki NK (NK1.1 +, CD3a) i T (CD3 +, NK1, lp) oczyszczono i znakowano fluorescencyjnie. Komórkom pozwolono przylgnąć do F-przywiązanej Ab, w obecności lub nieobecności rozpuszczalnego (100 nM) Fk. Pokazany eksperyment jest reprezentatywny dla trzech. Gwiazdka oznacza P <0,005. CX3CR1. /. a myszy CX3CR1 + / + rozwijają równie ciężkie uszkodzenie kłębuszkowe i śródmiąższowe. Fk ulega ekspresji na śródbłonku kłębuszkowym, a leukocyty niosące CX3CR1 infiltrują kłębuszki w modelu szczurów Wistar-Kioto z półksiężycowym kłębuszkowym zapaleniem nerek (10). W tym modelu, podawanie poliklonalnego Ab skierowanego przeciw szczurzemu CX3CR1 lub leczenie białkiem wirusowym vMIP-II hamowało infiltrację leukocytów i tworzenie się półksiężyców oraz polepszoną czynność nerek (10, 25). [więcej w: przygotowanie do rektoskopii, niedobór witaminy d3 objawy u dorosłych, szczepionki na meningokoki ] [podobne: laserowe wybielanie zębów cena, szczepionki na meningokoki, polana szymoszkowa basen ]