Utrata antagonisty BMP USAG-1 łagodzi choroby w mysim modelu postępującej dziedzicznej choroby nerek Zespół Alporta ad 8

Oceniono następujące parametry: odsetek kłębuszków krwotocznych i sklerotycznych kłębuszków; i wynik zwłóknienia śródmiąższowego / śródmiąższowego. Zanik kanalików / zwłóknienie śródmiąższowe oceniono następująco: stopień 0, 0%> 24%; stopień 1, 25%. 49%; stopień 2, 50%. 74%; ocena 3, . 75%. Zamrożone odcinki nerek zostały wybarwione immunologicznie, jak opisano wcześniej (63). Pierwotne przeciwciała były skierowane przeciwko podocynom (64), a1 (H11) i a3 (H31) łańcuchom kolagenu typu IV (dar od Y. Sado, nr kat. 65), MCP-1 (R & D Systems), MMP- 12 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), nNOS (Cayman Chemical i Abcam) i LacZ (Cappel Laboratory). W celu podwójnego barwienia z (3-gal, przeprowadzono barwienie immunologiczne przed znakowaniem. -Gal, aby uniknąć możliwości, że osadzanie X-gal może zakłócać wiązanie przeciwciała z antygenem. W mikroskopii elektronowej części kory zostały utrwalone w 2% aldehydem glutarowym i utrwalone w 1% roztworze kwasu osmowego. Po osadzeniu ultracienkie skrawki wybarwiono octanem uranu i cytrynianem ołowiu. P-Barwienie barwnikiem i hybrydyzacja in situ. Barwienie. -Gal i hybrydyzację in situ przeprowadzono jak opisano wcześniej (26, 66). Sonda do hybrydyzacji in situ mRNA USAG-1 zawierała otwartą ramkę odczytu o wielkości 1,0 kb z zawartością GC wynoszącą 52,6%. Hybrydyzację wykrywano stosując przeciwciało przeciwko digoksygeninie sprzężone z fosfatazą alkaliczną i błękitu nitro-tetrazoliowego / fosforanem 5-bromo-4-chloro-3-indolilu, sól 4-toluidynową (Roche Diagnostics). Immunoblot. Całą tkankę nerkową homogenizowano w buforze RIPA i poddawano immunoblottingu jak opisano wcześniej (67). Pierwotnymi przeciwciałami były anty-fosfo-Smad1 / 5/8 (Cell Signaling Technology), phospho-Smad2 (Upstate Biotechnology) i GAPDH (Fitzgerald Industries). Oznaczanie ilościowe mRNA za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym. RT-PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (27). Konkretne startery zaprojektowano przy użyciu oprogramowania Primer Express (Applied Biosystems). Serio rozcieńczony cDNA zastosowano do wygenerowania standardowej krzywej dla każdego startera, a warunki PCR były następujące: 50 ° C przez 2 minuty, 95 ° C przez 10 minut, następnie 95 ° C przez 15 sekund i 60 ° C przez minutę. minuta na 40 cykli. Hodowle komórkowe. Mysie komórki mezangialne ustalono z kłębuszków izolowanych z 4-tygodniowej prawidłowej myszy (C57BL / 6J) i scharakteryzowano jak opisano poprzednio (68). Komórki pasażowe o numerach od 18 do 21 hodowano w DMEM / F12 zawierającym 20% płodowej surowicy cielęcej. Ocena ekspresji mRNA MMP w komórkach mezangialnych. Komórki mezangium zaszczepiono w stężeniu 5 x 104 / ml. Po 24 godzinach pożywkę hodowlaną zastąpiono DMEM zawierającym 0,5% bydlęcej albuminy surowicy. Komórki inkubowano przez 72 godziny z 10 ng / ml MCP-1 (R & D Systems), 250 pg / ml IL-1 (3. (R & D Systems) lub 3 ng / ml TGF-a (R & D Systems) w obecności lub pod nieobecność 20 ng / ml BMP-7 (R & D Systems), a następnie analizowano pod kątem ekspresji mRNA MMP za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono czterokrotnie. Wytwarzanie rekombinowanego białka Flag USAG-1. Rekombinowane białko USAG-1 znakowane flagą C-końcowo (flaga USAG-1 (3) wytworzono przy użyciu Baculovirus Expression System (Invitrogen) i oczyszczono z pożywki hodowlanej przez absorpcję powinowactwa na perełkach powinowactwa anty-FLAG M2 (Sigma-Aldrich). Stężenie białka oszacowano metodą barwienia Coomassie. Zymography. Białka nerkowe ekstrahowano jak opisano wcześniej (69). Próbki wystandaryzowane do stężenia białka 60 .g / ścieżkę rozdzielano elektroforetycznie w 10% żelach SDS-poliakryloamidowych, które zawierały mg / ml żelatyny lub P-kazeiny. Po rozdzieleniu żele umieszczono w 2,5% Triton X-100 w PBS, przemyto i inkubowano w buforem rozwijającym (50 mM Tris, pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2 i 0,02% Brij-35) przez noc w 37 ° C. DO. Żele wybarwiono 0,5% błękitem Coomassie R250, a następnie odbarwiono 10% roztworem kwasu octowego, 40% roztworem metanolu aż do wyraźnego zaobserwowania pasm żelatynolitycznych. Systemowy transfer genów. Usag1. /. Col4a3. /. myszom wstrzyknięto 300 .l pcDNA3.1mUSAG-1 (cDNA dla mysiego USAG-1 wklonowanego do wektora ekspresyjnego pcDNA3.1) w mięsień przedni piszczelowej w 6 tygodniu, jak opisano (70) i analizowano po 8 tygodniach dla układu moczowego albumina i histologia nerek. Statystyka. Dane przedstawiono jako średnią. SD. Istotność statystyczną oceniano za pomocą testu Studenta dla 2 porównań grupowych i ANOVA, a następnie testu najmniejszych znaczących różnic post-hoc Fishera dla wielokrotnych porównań grup. Istotność zdefiniowano jako wartość P <0,05. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Podziękowania dla firmy Y. Kaziro, Y. Nabeshima i T. Nakamura za cenne komentarze i dyskusje. Dziękujemy również Y. Sado za doskonałe przeciwciała specyficzne dla podtypu przeciw kolagenowi typu IV oraz J. Nakamura, N. Suzuki i A. Hosotani za doskonałą pomoc techniczną. Badanie to zostało wsparte dotacjami Ministerstwa Edukacji, Kultury, Nauki, Sportu i Technologii Japonii (Wakate 177090551, Ho-ga 19659219, Kiban C 20590954), dotacji na badania w dziedzinie biologii Markery do badań nad nowymi lekami, naukami o zdrowiu i naukach lekarskich z Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej Japonii (08062855), dotacja z Fundacji Astellas ds. Badań nad zaburzeniami metabolicznymi, dotacja z Fundacji Novartis na promocję nauka, grant z Kato Memorial Trust dla Nambyo Research, dotacja z Fundacji Hayashi Memorial dla Kobiet Natural Scientists, dotacja z Fundacji Nauki Takeda oraz dotacja z Japan Foundation for Applied Enzymology. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Cytat za ten artykuł: J Clin Invest. 2010; 120 (3): 768 - 777. doi: 10,1172 / JCI39569. [więcej w: olej lniany na odchudzanie, szczepionki na meningokoki, tomaszowskie centrum zdrowia ] [hasła pokrewne: olej lniany na odchudzanie, niedobór witaminy d3 objawy u dorosłych, przygotowanie do rektoskopii ]