Utrata antagonisty BMP USAG-1 łagodzi choroby w mysim modelu postępującej dziedzicznej choroby nerek Zespół Alporta czesc 4

Poziomy fosforylacji Smad1 określono za pomocą systemu analizy obrazu LAS. Ostatnio kilka grup wykazało, że TGF-. aktywuje Smad1 / 5 oprócz Smad2 / 3 w komórkach śródbłonka poprzez nowe kompleksy receptorowe (32. 34). Tak więc postawiliśmy hipotezę, że zwiększona fosforylacja Smad1 / 5/8 w nerkach Usag1 + / + Col4a3. /. myszy mogły również wynikać z wysokiej ekspresji TGF-a. Aby przetestować tę hipotezę, zastosowaliśmy TGF-. do różnych typów komórek, w tym komórek MDCK, pierwotnych komórek mezangialnych, komórek NRK (komórek nabłonkowych kanalików szczura), komórek NIH3T3 i komórek HeLa, i wykazali, że TGF-a może aktywować fosforylację Smad1 / 5/8 oprócz Smad2 we wszystkich tych typach komórek (Figura 4B). Fosforylacja Smad1 / 5/8 była indukowana przez TGF-a. przy stężeniach tak niskich jak ng / ml (Figura 4C). Ponadto fosforylacja Smad1 / 5/8 w nerkach Usag1 + / + Col4a3. /. myszy dobrze korelowały z nerkową TGF-. jak również z poziomami kreatyniny w surowicy, ale nie z ekspresją BMP-7 (Figura 4D). Podsumowując, wyniki te wskazują, że zwiększona fosforylacja Smad1 / 5/8 w Col4a3. /. myszy mogą być spowodowane TGF-. sygnalizacja i atenuowana fosforylacja Smad1 / 5/8 w Usag1. /. Col4a3. /. myszy mogą odzwierciedlać zmniejszoną ekspresję TGF-a i nasilenie choroby. Usag1. /. Col4a3. /. myszy wykazywały mniejszą ekspresję i aktywność MMP w nerkach. Wcześniejsze doniesienia wykazały ważną rolę MMP w zwiększaniu wrażliwości wadliwego Alport GBM na degradację proteolityczną (9). Ekspresję mRNA MMP, o którym donosi się, że uczestniczy w tym modelu, zanalizowano w nerkach 10-tygodniowych myszy, co wykazało silną regulację w górę MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9 i MMP-2. 12 w nerkach Usag1 + / + Col4a3. /. myszy, podczas gdy ekspresja tych MMP była znacząco mniejsza w nerkach Usag1. /. Col4a3. /. myszy (Figura 5A). Aktywność proteolityczną tych MMP w ekstraktach z nerek określano również na podstawie kazeiny i zymografii żelatynowej. Zymografia kazeiny wykazała znaczące zmniejszenie aktywności MMP-7 i MMP-12 (Figura 5B), a zymografia żelatynowa wykazała znaczące zmniejszenie aktywności MMP-2 w nerkach Usag1. /. Col4a3. /. myszy w porównaniu z Usag1 + / + Col4a3. /. myszy (Figura 5C). Ponadto prążki widoczne w 57 i 45 kDa w zymografii żelatynowej, prawdopodobnie reprezentujące aktywność MMP-3 (35), były znacznie mniejsze w nerkach z Usagl . /. Col4a3. /. myszy. Ostatnio wykazano, że ekspresja MMP-12 była znacznie podwyższona w kłębuszkach Usag1 + / + Col4a3. /. myszy, a hamowanie MMP-12 zachowało integralność GBM (29). Immunobarwienie dla MMP-12 wykazało znaczną regulację w górę w kłębuszkach i śródmiąższu Usag1 + / + Col4a3. /. myszy, podczas gdy indukcja została osłabiona w Usag1. /. Col4a3. /. myszy (Figura 5D). Podczas gdy MMP-12 jest wyrażany przez makrofagi, jak również komórki kłębuszkowe, takie jak podocyty (29, 36, 37), immunobarwienie CDllb, markera monocytów i makrofagów tkankowych, nie wykazało żadnej znaczącej infiltracji makrofagów lub monocytów w kłębuszkach 10-tygodniowe Usag1 + / + Col4a3. /. myszy (dane nie pokazane), co sugeruje, że kłębuszkowe MMP-12 u myszy Alport nie było spowodowane makrofagami, które infiltrowały kłębuszki. Rysunek 5Usag1. /. Col4a3. /. myszy wykazywały mniejszą ekspresję i aktywność MMP w nerkach. (A) Analiza RT-PCR w czasie rzeczywistym mRNA MMP w nerkach myszy z miotu WT (WT / WT), Usag1 + / + Col4a3. /. myszy, (WT / KO) i Usag1. /. Col4a3. /. myszy (KO / KO) w wieku 10 tygodni. Poziomy ekspresji znormalizowano do poziomu GAPDH i wyrażono w stosunku do tych w miotach WT z miotu (n = 10). Bary oznaczają średnią. SD. * P <0,001; ** P <0,01. (B) Zymografia kazeiny analizująca nerki myszy z miotu WT (WT / WT), Usag1 + / + Col4a3. /. myszy (WT / KO) i Usag1. /. Col4a3. /. myszy (KO / KO) w wieku 10 tygodni. (C) Zymografia żelatyny analizująca nerki myszy z miotu WT (WT / WT), Usag1 + / + Col4a3. /. myszy (WT / KO) i Usag1. /. Col4a3. /. myszy (KO / KO) w wieku 10 tygodni. (D) Reprezentatywne immunobarwienie MMP-12 w nerkach myszy z miotu WT (WT / WT), Usag1 + / + Col4a3. /. myszy (WT / KO) i Usag1. /. Col4a3. /. myszy (KO / KO) w wieku 10 tygodni. Pręty skali: 100 .m. USAG-1 nie ulegał ekspresji w kłębuszkach Alport. USAG-1 jest wyrażany głównie w dystalnych kanalikach, dokładniej w grubej wstępującej kończynie, dystalnych kanalikach i łączących kanalikach w nerkach dorosłych, i nie ulega ekspresji w kłębuszkach (26). Hybrydyzację in situ zastosowano do określenia ekspresji USAG-1 w Usag1 + / + Col4a3. /. myszy i wykazali, że ekspresja USAG-1 nie była wykrywalna w kłębuszkach Usag1 + / + Col4a3. /. myszy (Figura 6A) i był ograniczony do kanalików. Figura 6USAG-1 kolokalizuje z BMP-7 w plamce żółtej i hamuje działanie BMP-7 w komórkach mezangialnych [podobne: tomaszowskie centrum zdrowia, depilacja laserowa twarzy, laserowe wybielanie zębów cena ] [przypisy: depilacja laserowa twarzy, badania kontrolne po urlopie macierzyńskim, laserowe wybielanie zębów cena ]